<em> Экс естественных</em> Модель для изучения действия гормонов в груди человека
Summary
Мы разработали новую Экс Vivo модель для изучения действия гормонов в груди человека. Он основан на ткани микроструктур, выделенных из хирургические образцов ткани молочной железы, сохраняющих ткани архитектуру, межклеточные взаимодействия и паракринную сигнализации.
Abstract
Исследование действия гормонов в груди человека был затруднен из-за отсутствия адекватных модельных системах. По культуре в пробирке, первичные эпителиальные клетки молочных желез, как правило, теряют экспрессии рецептора гормона. Широко используются гормон рецепторов линии положительное клеток рака молочной железы имеют ограниченное отношение к в естественных условиях ситуации. Здесь мы опишем Экс Vivo модель для изучения действия гормонов в груди человека. Свежие образцы молочной железы человека из тканей хирургическим сброса материала, такого как mammoplasties сокращения или mammectomies механически и ферментативно переваривается, чтобы получить фрагменты тканей, содержащих каналы и дольки и несколько типов стромальных клеток. Эти ткани микроструктуры хранящиеся в базальной среде без факторов роста сохраняют свои межклеточные контакты, архитектура ткани и остаются гормона реагировать в течение нескольких дней. Они легко обрабатываются для РНК и извлечения белка, гистологического анализа или хранить в замораживании среду. ФлуоресценцияАктивированный сортировки клеток (FACS) может быть использован для обогащения конкретных клеточных популяций. Этот протокол обеспечивает простой, стандартный подход для трансляционных исследований с исключительно сложной, разнообразной человека образцов.
Introduction
Информация о мутационный пейзаж рака молочной железы увеличивается на быстром темпе. Меньше внимания уделялось системных факторов, которые влияют на развитие рака молочной железы. Воздействие половых гормонов имеет большое влияние на прогрессирование заболевания 1-3. Тем не менее, механизмы, с помощью которых репродуктивные гормоны посягают на груди человека мало изучены. Работа с генетически мышиных моделях показали, что они связаны с клеточной внутренней и паракринную сигнализацию через несколько нижестоящих эффекторов 4.
Ограниченные знания о действия гормонов в груди человека в значительной степени объясняется отсутствием адекватных моделей. Большая часть работы по механизмам рецептора эстрогена (ER) и рецептора прогестерона (PR) сигнализации была выполнена с рецептор к гормону клеточных линий рака молочной железы, таких как MCF-7 и T47D. Они были получены из плеврального выпота у пациентов с распространенным раком молочной железы, которые были alreaду получил несколько процедур 5. Биологическая значимость результатов в таких простых моделей в пробирке в человеческой груди является спорным вопросом, гены-мишени, указанные в этих моделях в пробирке отличаются от генов-мишеней, которые определены в животных моделях 6. При первичной молочной железы человека эпителиальные клетки культивируют в пробирке, они теряют экспрессию рецептора гормона и, следовательно, гормон ответ 7,8. Эта проблема может быть circumventd изощренными 3D подходов с использованием Матригель. Таким образом, Кларк и его коллеги преуспели в создании молочной железы эпителиальные клетки, которые поддерживали экспрессию рецептора гормона и показал пролиферативного ответа на стимуляцию прогестерона 9. Тем не менее, два важных в естественных целевых генов рецептора прогестерона, Wnt-4 и RANKL, не индуцируется при стимуляции прогестерона в этой системе 9. Этот подход был недавно принял дальше с в пробирке </EM> гормон предварительной обработки и индукция RANKL была достигнута 10. Предостережение остается то, что матригель имеет виды деятельности, которые партия-зависимыми, стоит дорого, и требует экспериментального дизайна, что, вероятно, для только небольшое количество клеток.
Основано на обнаружении того, что в естественных условиях ER и PR сигналов в значительной степени, опосредованного паракринных взаимодействий 11, мы утверждали, что межклеточные взаимодействия должны быть сохранены. Еще одним важным фактором, который теряется в виде тканей диссоциируют на отдельные клетки культуры в пробирке являются взаимодействия эпителиальных клеток с внеклеточным матриксом; пока они имеют решающее значение для дифференциации эпителиальных и их нарушение является важным в туморогенеза 12. Имея это в виду, мы разработали способ, чтобы изолировать ткани молочной железы микроструктур из свежих хирургического сброса материала 13. Паренхимы, состоящий из двухслойного эпителия с внутренней просвета и наружной myoepitheliAl клетки, отсечен от жировой ткани и подвергают механической и ферментативной диссоциации. После промывки и центрифугирования, фрагменты молочных протоков получаются, которые сохраняют тесное взаимодействие со многими стромальных клеток. Эти ткани микроструктуры остаются гормон реагировать. Модель была подтверждена в клинических образцах 13. Таким образом, настоящее процедура может помочь изучать действие гормонов в груди в биологически и клинически соответствующем контексте.
Protocol
Representative Results
Discussion
Культура экс естественных описано здесь, представляет собой ткани микроструктуры груди, содержащие интактные каналы и дольки, наряду с другими типами клеток, обычно находящиеся в человеческом женской груди. При обработке ткани молочной железы человека, как правило, полученного и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят М. FICHE Университетского госпиталя Лозанны для обеспечения маммопластика фотографию, М. Вирт и А. Ayyanan из Швейцарского института экспериментальных исследований рака, Национальный центр компетенции в области исследований молекулярной онкологии, школа естественных наук, Высшей Федеральной политехнической де Лозанна для оказания технической помощи и Р. Кларк Университета Манчестера за критические замечания. Научных исследований, ведущих к этим результатам получил поддержку от SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531817, и инновационных лекарственных средств инициатива совместного проекта под грантового соглашения нет. 115188, ресурсы которой состоят из финансового вклада Седьмой рамочной программы Европейского Союза (FP7 / 2007-2013) и Европейской федерации фармацевтической промышленности и ассоциаций компаний в своем роде вклад. Веб-адрес Инициативу по инновационным лекарственным это http://www.imi.europa.eu/ . </ P>
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
| Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
| Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
| CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
| Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
| Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
| Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
| Scalpel | Aesculap | BB084R | |
| Forceps | Aesculap | BD047R | |
| Scissors | Aesculap | BC374R | |
| Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | Fetal Bovine Serum |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37°C) |
| Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37°C) |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
| Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Ethanol | Merck | 1009831000 | |
| Cryogenic vials (5.0ml) | VWR, International | 479-0820 | |
| Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |
References
- Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
- MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
- Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. ‘Hormonal’ risk factors, ‘breast tissue age’ and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
- Brisken, C., O’Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).
- Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
- Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
- Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
- Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
- Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
- Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
- Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
- Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
- Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).
