Um<em> Ex vivo</em> Modelo para estudar a ação do hormônio no peito humano
Summary
Desenvolvemos um novo modelo ex vivo para estudar a acção da hormona no peito humano. Baseia-se em microestruturas dos tecidos isolados de amostras de tecidos mamários cirúrgicos que preservam a arquitetura do tecido, as interações intercelulares, e sinalização parácrina.
Abstract
O estudo da ação do hormônio no peito humano tem sido dificultada pela falta de sistemas de modelos adequados. Após a cultura in vitro, células epiteliais mamárias primários tendem a perder a expressão de receptores hormonais. Amplamente receptores hormonais linhas celulares de cancro da mama positivo utilizados são de limitada relevância para a situação in vivo. Aqui, descrevemos um modelo ex vivo para estudar a ação hormonal no peito humano. Amostras frescas de tecido da mama humano a partir de material de descarte cirúrgico, tais como mamoplastias de redução ou mammectomies são mecanicamente e enzimaticamente digerido para obter fragmentos de tecido contendo ductos e lóbulos e vários tipos de células do estroma. Estes micro-estruturas dos tecidos conservados em meio basal sem fatores de crescimento preservar seus contatos intercelulares, a arquitetura do tecido, e permanecem hormônio que responde por vários dias. Eles são processados prontamente para RNA e extração de proteínas, análise histológica ou armazenados em meio de congelamento. Fluorescênciaseparação de células activadas (FACS) pode ser usado para o enriquecimento em populações de células específicas. Este protocolo fornece uma abordagem simples, padrão para estudos translacionais com alta complexidade, amostras humanas variadas.
Introduction
Informações sobre a paisagem mutacional no câncer de mama está aumentando em ritmo acelerado. Menos atenção tem sido dada a fatores sistêmicos que influenciam o desenvolvimento do câncer de mama. A exposição a hormônios reprodutivos tem um grande impacto na progressão da doença 1-3. No entanto, os mecanismos pelos quais as hormonas reprodutivas embatem na mama humano são mal compreendidos. Trabalho com modelos de engenharia genética do rato revelou que envolvem células sinalização intrínseca e paracrine por vários efectores a jusante 4.
O conhecimento limitado sobre ação do hormônio no peito humano é largamente atribuível à falta de modelos adequados. A maioria dos trabalhos sobre os mecanismos de receptor de estrogénio (ER) e o receptor de progesterona (PR), a sinalização tem sido realizada com linhas de células positivas do receptor de hormona, cancro da mama, tais como MCF-7 e T47D. Estes foram obtidos a partir de derrame pleural de pacientes com câncer de mama avançado que tinha already recebeu vários tratamentos 5. A importância biológica dos resultados obtidos em tais modelos in vitro simples da mama humano é genes questionáveis e alvo identificados nestes modelos in vitro são diferem dos genes-alvo que são identificados em modelos animais 6. Quando as células epiteliais mamárias humanas primárias são cultivadas in vitro tendem a perder a expressão de receptores hormonais e, portanto, resposta hormonal 7,8. Este problema pode ser circumventd por abordagens 3D sofisticados usando matrigel. Desta forma, C. Clarke e colegas conseguiram estabelecer as células epiteliais da mama que mantiveram a expressão do receptor da hormona e que demonstraram uma resposta proliferativa para a estimulação da progesterona 9. No entanto, importante em dois genes alvo in vivo do receptor da progesterona, Wnt-4 e RANKL, não foram induzidas por estimulação da progesterona no presente sistema 9. Esta abordagem foi tomada recentemente em mais longe com in vitro </em> pré-tratamento hormonal e indução RANKL foi alcançado 10. A ressalva é que matrigel tem atividades que são dependentes do lote, é caro, e exige um projeto experimental que está apto apenas para o número de células pequenas.
Com base na descoberta de que em ER vivo e sinalização PR são largamente mediada por interacções parácrinos 11, que argumentaram que as interacções intercelulares precisam de ser mantidas. Outro factor importante que é perdida como tecidos estão dissociados para células únicas para a cultura in vitro são as interacções de células epiteliais com a matriz extracelular; No entanto, estes são fundamentais para diferenciação epitelial e sua perturbação é importante na tumorigênese 12. Com isto em mente, nós estabelecemos um método para isolar microestruturas tecido mamário a partir de material de descarte cirúrgico fresco 13. O parênquima da mama, que consiste de um epitélio de duas camadas com o interior do lúmen e exterior myoepithelicélulas al, é dissecado a partir de tecido adiposo e submetido a dissociação mecânica e enzimática. Após a lavagem e centrifugação, fragmentos de dutos de leite são obtidos que manter interações estreitas com muitas células estromais. Estes micro-estruturas dos tecidos permanecem hormônio responsivo. O modelo foi validado em amostras clínicas 13. Como tal, o presente processo pode ajudar a estudar a acção de hormonas na mama num contexto biológico e clinicamente relevante.
Protocol
Representative Results
Discussion
A cultura ex vivo descrito aqui fornece microestruturas dos tecidos mamários contendo ductos e lóbulos intactos, juntamente com outros tipos de células encontradas normalmente no peito fêmea humana. No processamento do tecido da mama humana obtidos geralmente de mamoplastias de redução, a remoção de tecido adiposo, a digestão enzimática e mecânica da matriz estromal, e a lise de células vermelhas do sangue enriquece para fragmentos de condutas de leite e unidades lobulares ductais terminais. Digest?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem M. Fiche do Hospital Universitário de Lausanne para fornecer a fotografia mamoplastia, M. Wirth e A. Ayyanan do Swiss Institute for Cancer Research Experimental, Centro Nacional de Competência em Pesquisa de Oncologia Molecular, Faculdade de Ciências da Vida, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne para a assistência técnica e R. Clarke, da Universidade de Manchester para comentários críticos. A investigação conducente a estes resultados foi recebido apoio de SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, eo Innovative Medicines Initiative empresa comum ao abrigo do contrato de concessão não. 115.188, recursos de que são compostas de contribuição financeira do Sétimo Programa da União Europeia Quadro (FP7 / 2007-2013) e Federação Europeia das Associações e Indústrias Farmacêuticas empresas »da contribuição em espécie. O endereço Web de Iniciativa sobre Medicamentos Inovadores é http://www.imi.europa.eu/ . </ P>
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
| Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
| Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
| CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
| Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
| Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
| Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
| Scalpel | Aesculap | BB084R | |
| Forceps | Aesculap | BD047R | |
| Scissors | Aesculap | BC374R | |
| Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | Fetal Bovine Serum |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37°C) |
| Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37°C) |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
| Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Ethanol | Merck | 1009831000 | |
| Cryogenic vials (5.0ml) | VWR, International | 479-0820 | |
| Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |
References
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