En<em> Ex vivo</em> Modell för att studera Hormone Action i Human Breast
Summary
Vi har utvecklat ett nytt ex vivo modell för att studera hormonverkan i människobröst. Den är baserad på vävnadsmikro isolerade från kirurgiska bröstvävnadsprover som bevarar vävnadsarkitektur, intercellulära interaktioner, och parakrin signalering.
Abstract
Studien av hormonet åtgärder på människans bröst har försvårats av bristen på lämpliga modellsystem. Vid in vitro-kultur, primära bröstepitelceller tenderar att förlora hormonreceptoruttryck. Allmänt använda hormonreceptorpositiv bröstcancer cellinjer är begränsad relevans för in vivo situationen. Här beskriver vi en ex vivo-modell för att studera hormonverkan i människobröst. Färska humana bröstvävnadsprover från kirurgiska kasserat material såsom reduktions mammoplasties eller mammectomies är mekaniskt och enzymatiskt rötas för att erhålla vävnadsfragment som innehåller kanaler och lobules och flera typer stromal cell. Dessa vävnadsmikro hålls i basal medium utan tillväxtfaktorer bevara sina intercellulära kontakter, vävnaden arkitekturen, och förblir hormon lyhörd i flera dagar. De är lätt behandlas för RNA och protein extraktion, histologisk analys eller lagras i frysmedium. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) kan användas för att anrika specifika cellpopulationer. Protokollet ger en enkel, vanlig metod för translation studier med mycket komplexa, varierade humana prover.
Introduction
Information om mutations landskapet i bröstcancer ökar i snabb takt. Mindre uppmärksamhet har ägnats åt system faktorer som påverkar bröstcancerutveckling. Exponering för reproduktiva hormoner har en stor inverkan på sjukdomsförloppet 1-3. Ändå är de mekanismer genom vilka reproduktiva hormoner påverkar den mänskliga bröst dåligt kända. Arbeta med genetiskt modifierade musmodeller har avslöjat att de innebär cell inneboende och parakrint signalering genom flera nedströms effekten 4.
Den begränsade kunskapen om hormon åtgärder på människans bröst är till stor del hänförlig till en brist på lämpliga modeller. De flesta arbetar på de mekanismer för östrogenreceptor (ER) och progesteronreceptorn (PR) signalering har utförts med hormonreceptorpositiv bröstcancer cellinjer, såsom MCF-7 och T47D. Dessa härleddes från pleurala utgjutningar från patienter med avancerad bröstcancer som hade already fått flera behandlingar 5. Den biologiska relevansen av resultaten i sådana enkla in vitro-modeller av människobröst är tvivelaktiga och målgener identifierats i dessa in vitro-modeller är skiljer sig från målgener som identifieras i djurmodeller 6. När primära humana bröst epitelceller odlas in vitro tenderar de att förlora hormonreceptoruttryck och därmed hormonsvar 7,8. Detta problem kan circumventd med sofistikerade 3D tillvägagångssätt med matrigel. På detta sätt, C. Clarke och kollegor lyckats etablera bröstepitelceller som underhålls hormonreceptorexpression och som visade ett proliferativt svar på progesteron stimulering 9. Ändå två viktiga in vivo progesteronreceptor målgener, Wnt-4 och RANKL, inte inducerades vid progesteron stimulering i detta system 9. Detta tillvägagångssätt har nyligen tagit på ytterligare med in vitro </em> hormon förbehandling och RANKL induktion uppnåddes 10. En varning kvarstår att matrigel har aktiviteter som är satsberoende, är dyrt, och kräver en experimentell design som är apt för små cell endast siffror.
Utifrån konstaterandet att in vivo ER och PR-signalering till stor del medieras av parakrina interaktioner 11, hävdade vi att intercellulära interaktioner måste upprätthållas. En annan viktig faktor som går förlorad som vävnader dissocieras till enskilda celler för in vitro-kultur är växelverkan av de epitelceller med den extracellulära matrisen; men dessa är avgörande för epitelial differentiering och deras störningar är viktig i tumörbildning 12. Med detta i åtanke har vi etablerat en metod för att isolera bröstvävnadsmikro från färsk kirurgisk kasserat material 13. Bröstet parenkym, som består av en två-skiktad epitel med inner luminal och yttre myoepithelial-celler, dissekeras bort från fettvävnad och utsattes för mekanisk och enzymatisk dissociation. Efter tvättning och centrifugering, är fragment av mjölkgångarna erhålls som behåller nära samspel med många stromaceller. Dessa vävnadsmikro förblir hormon lyhörd. Modellen validerades i kliniska prover 13. Som sådan, kan detta förfarande bidra till att studera hormon åtgärder i bröstet i en biologiskt och kliniskt relevant sammanhang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ex vivo kulturen beskrivs här ger bröstvävnad mikrostrukturer som innehåller intakta kanaler och lobules, tillsammans med andra celltyper som normalt finns i den mänskliga kvinnliga bröst. Vid bearbetningen av den humana bröstvävnad erhålls vanligen från reduktions mammoplasties, avlägsnande av fettvävnad, mekanisk och enzymatisk nedbrytning av den stromala matrisen och lys av röda blodkroppar berikar för mjölkkanal fragment och terminala duktala lobulära enheter. Gentle enzymatisk spjälkni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar M. Fiche av Universitetssjukhuset i Lausanne för att tillhandahålla mammoplasty fotografiet, M. Wirth och A. Ayyanan schweiziska institutet för experimentell cancerforskning, National Center of Competence i forskning molekylär onkologi, Institutionen för livsvetenskaper, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne för tekniskt bistånd och R. Clarke för University of Manchester för kritiska kommentarer. Den forskning som leder till dessa resultat har erhållit stöd från SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, och innovativa gemensamma företaget Medicines Initiative enligt bidragsavtal nr. 115188, varav resurser består av ekonomiska bidrag från EU: s sjunde ramprogram (FP7 / 2007-2013) och Europeiska federationen för läkemedelsbranschorganisationen företagens naturabidrag. Webbadressen Initiativet för innovativa läkemedel är http://www.imi.europa.eu/ . </ P>
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
| Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
| Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
| CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
| Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
| Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
| Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
| Scalpel | Aesculap | BB084R | |
| Forceps | Aesculap | BD047R | |
| Scissors | Aesculap | BC374R | |
| Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | Fetal Bovine Serum |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37°C) |
| Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37°C) |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
| Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Ethanol | Merck | 1009831000 | |
| Cryogenic vials (5.0ml) | VWR, International | 479-0820 | |
| Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |
References
- Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
- MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
- Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. ‘Hormonal’ risk factors, ‘breast tissue age’ and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
- Brisken, C., O’Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).
- Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
- Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
- Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
- Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
- Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
- Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
- Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
- Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
- Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).
