Een gestandaardiseerde methode voor de analyse van lever sinusoïdale endotheelcellen en hun fenestraties van Scanning Electron Microscopy
Summary
The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.
Abstract
Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures – both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.
Introduction
De lever sinusoïdale endotheelcellen (LSECs) sterk gedifferentieerde endotheelcellen die de wand van de hepatische sinusoïde lijn. LSECs worden geperforeerd met fenestraties die niet diaphragmed, transcellulaire poriën 50-250 nm in diameter. Tot 20% van het oppervlak van LSECs onder fenestrations, die meestal in groepen van tientallen tot honderden genoemd zeefplaten 03/01 (figuur 1). Fenestraties mogelijk overdracht van plasma en nanosubstrates tussen bloed en hepatocyten, zodat een efficiëntere ultrafiltratiesysteem. Fenestraties zijn dynamische structuren – zowel hun afmeting en / of het aantal kan worden veranderd in reactie op verschillende fysiologische toestanden, drugs en ziekte. Bijvoorbeeld, fenestraties zijn groter in de nuchtere dan in de gevoede toestand 4; 2-di-joodamfetamine vergroot fenestration nummer, 5,6 en minder grootte en het aantal fenestraties per cel voorkomt bij veroudering en vele ziektetoestanden 7-13 </sup>. Nauwkeurige meting van de grootte en het aantal fenestraties is belangrijk om te begrijpen hoe LSEC morfologie wordt beïnvloed door ziekte, toxisch en fysiologische toestanden; hun invloed op de werking van de lever; en voor de ontwikkeling fenestration-modulerende therapeutische interventies 1.
De studie fenestraties moeilijk. De diameter van fenestraties ligt onder de resolutie van conventionele lichtmicroscopie, dus voorheen alleen observatie met behulp van elektronenmicroscopie, zowel in intacte leverweefsel of gekweekte LSECs mogelijk is geweest. De scanning elektronenmicroscoop (SEM) is het meest frequent gebruikt raamopeningen grootte, frequentie en porositeit (het percentage LSEC membraan dat is geperforeerd door fenestrations) bestuderen omdat SEM zorgt voor waarneming van grote gebieden van het endotheliale oppervlak en meting van duizenden, zoniet tienduizenden fenestraties. Ondanks het nut, de resultaten die zijn gemeld uit SEM-gebaseerde studies voorLSEC parameters zoals fenestratie grootte, aantal en frequentie porositeit verschillen sterk in de literatuur (Tabel 1).
Fenestraties en zeefplaten zijn kwetsbare structuren die overeenkomst, te breken, verwijden of samensmelten tijdens het prepareren, is dus zorgvuldige verwerking die nodig is om hun integriteit te bewaren. Verhoogde perfusiedruk 14; incorrect osmolariteit van het fixeermiddel en de buffers 15; onvoldoende fixatie of fixatie tijd; en de snelheid van post-fixatie dehydratatie en drogen worden alle gebieden van de verwerking SEM die artefacten die interfereren met behoud van ultrastructuur (figuur 2) kunnen veroorzaken. Verlies van fenestraties (doorvallen) raamstellingen krimp kan optreden als gevolg van slechte fixatie resulteert in verminderde diameter fenestratie en cellen porositeit. Werkwijzen voor het behoud van specimens SEM analyse te verbeteren zijn eerder beschreven en 15-17 worden besprokenhier met extra tips over hoe om specimen behoud te verbeteren. De hoofddoelen van het monster bewaring bloed van de sinusoïden verwijderd zodat het oppervlak van de LSEC worden gevisualiseerd en LSEC beschadiging van zowel hoge druk of vertraagd fixatie te voorkomen. Hele leverperfusie fixeermiddel via de poortader is de voorkeursmethode voor lever fixatie. Zoals elders in detail 16,18 perfusie moet plaatsvinden bij lage druk (bijvoorbeeld 10 cm H 2 0) tot drukgerelateerde perfusie artefacten en schade aan de LSEC voorkomen, meestal manifesteert als grote gaten in het celmembraan. Echter, redelijke fixatie vaak worden verkregen met behulp naald perfusie van de lever biopten van mensen en dieren, zoals elders in detail beschreven 19. Deze techniek omvat het direct inspuiten fixatief in het weefsel totdat het bloed wordt gespoeld uit het monster en het weefsel is stevig en vast. Fixatie van monsters voor elektronenmicroscopie perf moet wordenormed zo snel mogelijk na het stoppen van de bloedstroom naar ultrastructurele veranderingen optreden als gevolg van de levers uiterst snelle autolytisch processen voorkomen.
We stellen ook een werkwijze voor beeldanalyse die het opnemen van voorwerpen minimaliseert en standaardiseert het meten van fenestrations. Variatie in de keuze van sinusoïden voor microfoto, beeldanalyse van artefacten, en meting van celoppervlak voor porositeit en fenestration frequentie hebben geleid tot grote verschillen in gepubliceerde resultaten. Een gestandaardiseerde aanpak voor de evaluatie en meting van fenestraties en de minimale vereisten voor de presentatie van gegevens niet duidelijk zijn behandeld in de literatuur eerder 4,10,20-31.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mogelijkheid om de status van de lever sinusoïdale endotheel nauwkeurig en reproduceerbaar te meten is een belangrijke stap in begrip van de biologie van deze zeer gespecialiseerde cellen. Nieuwere technieken zoals gestructureerde verlichting microscopie 32, atomic force microscopie 33 en d-STORM (direct Stochastic Reconstrucion Optische microscopie) 34 levert belangrijke informatie geven over de morfologie van deze cellen in vitro, maar SEM blijft de belangrijkste methode v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue Number | Comments |
| EM grade Glutaraldehyde | ProSciTech | C001 | Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze |
| Paraformaldehyde powder | Sigma Aldrich | 158127 | Always prepare Paraformaldehyde fresh |
| Sodium Cacodylate powder | Sigma Aldrich | C0250 | Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016 | Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O |
| Osmium tretroxide | ProSciTech | C011 | Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle |
| Ethanol- Absolute | Sigma Aldrich | 459836 | 100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve |
| Other grades of Ethanol | Labtech | EL5 | Prepare graded Ethanols with dH2O |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 52619 | Allow to reach room temperature before use |
| Cannulas | Terumo | TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C | 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice |
| Conductive Carbon tape | ProSciTech | IA0201 | |
| Carbon Paint | ProSciTech | I003 | |
| Ketamine | Must be optained under licence | ||
| Xylazine | Must be obtained under licence | ||
| Molecular Sieve | Sigma Aldrich | 208647 | Removes water from the 100 % Ethanol |
Riferimenti
- Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., Arias, I. M. . The Liver: Biology and Pathobiology. , 387-404 (2009).
- Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
- Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).
- Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).
- Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).
- Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).
- Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).
- Le Couteur, D. G., Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. . Calorie Restriction, Aging and Longevity. , 191-216 (2010).
- McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).
- Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).
- Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).
- Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).
- Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).
- Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).
- Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).
- Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).
- Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).
- Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).
- Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. , (2014).
- May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6 (7), e21478 (2011).
- Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).
- Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).
- Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).
- Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).
- Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).
- Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).
- Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).
- Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).
- Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).
- Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).
- Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).
