Une méthode standardisée pour l'analyse des cellules endothéliales et sinusoïdale du foie Leurs fenestrations par microscopie électronique à balayage
Summary
The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.
Abstract
Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures – both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.
Introduction
Les cellules endotheliales sinusoïdales hépatiques (LSECs) sont très différenciées des cellules endothéliales qui tapissent la paroi de la sinusoïde hépatique. LSECs sont perforées avec des fenestrations qui sont non diaphragmée, transcellulaire des pores de 50 à 250 nm de diamètre. Jusqu'à 20% de la surface de LSECs est couverte par fenestrations, qui sont habituellement en groupes de quelques dizaines à quelques centaines appelés plateaux perforés 1 à 3 (figure 1). Fenestrations permettent le transfert de plasma et nanosubstrates entre le sang et les hépatocytes, la création d'un système d'ultrafiltration est performant. Fenestrations sont des structures dynamiques – à la fois leur taille et / ou le numéro peuvent être modifiées en réponse à différents états physiologiques, les médicaments et la maladie. Par exemple, fenestrations sont plus grandes dans le jeun que dans l'état nourri 4; 2-di-iodoamphétamine augmente numéro de fenestration; 5,6 et une réduction de la taille et du nombre de fenestrations par cellule se produit au cours du vieillissement et de nombreux états pathologiques 7-13 </sup>. La mesure précise de la taille et du nombre de fenestrations est important pour comprendre comment LSEC morphologie est influencé par diverses maladies, toxiques, et les états physiologiques; leur impact sur la fonction hépatique; et pour le développement de fenestration modulation des interventions thérapeutiques 1.
L'étude de fenestrations est difficile. Le diamètre de fenestrations est inférieure à la résolution de la microscopie optique classique, de sorte que précédemment microscopie électronique d'observation en utilisant à la fois LSECs de tissus du foie ou de culture a été possible intactes. Le microscope électronique à balayage (MEB) a le plus souvent été utilisée pour étudier la taille de fenêtrage, de la fréquence et de la porosité (pourcentage de membrane LSEC qui est perforée par des fenestrations) car SEM permet l'observation de vastes zones de la surface de l'endothélium et la mesure des milliers, sinon des dizaines de milliers de fenestrations. Malgré son utilité, les résultats qui sont rapportés de SEM-basés pour des étudesLSEC paramètres tels que la taille de la fenestration, le nombre, la fréquence et la porosité varient largement dans la littérature (tableau 1).
Fenestrations et des plaques de tamis sont des structures fragiles de ce contrat, se brisent, se dilatent ou se unissent pendant la préparation de l'échantillon, le traitement ainsi minutieuse est nécessaire pour préserver leur intégrité. La pression de perfusion élevée 14; osmolarité incorrecte du fixateur et tampons 15; une mauvaise fixation ou la fixation du temps; et la vitesse de post-fixation déshydratation et séchage sont tous les domaines de la transformation des SEM qui peuvent produire des artefacts qui interfèrent avec la préservation de l'ultrastructure (Figure 2). La perte de fenestrations ('defenestration') et fenestration rétrécissement peut se produire à la suite d'une mauvaise fixation, ce qui entraîne diamètre réduit de fenêtrage et la porosité de la cellule. Méthodes pour améliorer la conservation des spécimens pour analyse SEM ont été décrits précédemment 15-17 et seront discutésici avec des conseils supplémentaires sur la façon d'améliorer la conservation de l'échantillon. Les principaux objectifs de la préservation de l'échantillon sont pour enlever le sang des sinusoïdes de telle sorte que la surface de la LSEC peut être visualisé et pour éviter d'endommager LSEC soit de haute pression ou de la fixation retardée. Toute perfusion du foie de fixateur via la veine porte est la méthode préférée pour la fixation du foie. Comme décrit en détail ailleurs 16,18 perfusion doit être effectué à basse pression (par exemple 10 cm de H 2 0) pour éviter les artefacts et les dommages liés à la pression de perfusion à l'LSEC, manifestent généralement que de grandes lacunes au sein de la membrane cellulaire. Toutefois, la fixation raisonnable peut souvent être obtenue en utilisant l'aiguille de perfusion biopsies du foie provenant d'humains et d'animaux, comme décrit en détail par ailleurs 19. Cette technique consiste à injecter directement fixateur dans le tissu jusqu'à ce que le sang est évacuée de l'échantillon et le tissu est ferme et fixe. Fixation d'échantillons pour la microscopie électronique doit être perfOrmed aussi rapidement que possible après l'arrêt de la circulation sanguine pour éviter les changements ultrastructuraux survenant à la suite des foies des processus d'autolyse extrêmement rapides.
Nous présentons également une méthode d'analyse d'image qui réduit au minimum l'inclusion d'artefacts, et normalise la mesure de fenestrations. Variation dans la sélection des sinusoïdes pour microscopie, analyse d'images d'objets, et la mesure de la surface de la cellule pour la porosité et la fenestration fréquence ont conduit à des écarts importants dans les résultats publiés. Une approche normalisée pour l'évaluation et la mesure des fenestrations et les exigences minimales pour la présentation des données ne sont pas clairement abordée dans la littérature précédemment 4,10,20-31.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacité de mesurer de façon précise et reproductible l'état du foie endothélium sinusoïdal est une étape importante dans la compréhension de la biologie de ces cellules hautement spécialisées. De nouvelles techniques telles que la microscopie d'éclairage structuré 32, microscopie à force atomique 33 et d-STORM (directe stochastique optique reconstrucion Microscopy) 34 seront de communiquer des informations importantes concernant la morphologie de ces cellules…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue Number | Comments |
| EM grade Glutaraldehyde | ProSciTech | C001 | Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze |
| Paraformaldehyde powder | Sigma Aldrich | 158127 | Always prepare Paraformaldehyde fresh |
| Sodium Cacodylate powder | Sigma Aldrich | C0250 | Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016 | Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O |
| Osmium tretroxide | ProSciTech | C011 | Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle |
| Ethanol- Absolute | Sigma Aldrich | 459836 | 100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve |
| Other grades of Ethanol | Labtech | EL5 | Prepare graded Ethanols with dH2O |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 52619 | Allow to reach room temperature before use |
| Cannulas | Terumo | TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C | 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice |
| Conductive Carbon tape | ProSciTech | IA0201 | |
| Carbon Paint | ProSciTech | I003 | |
| Ketamine | Must be optained under licence | ||
| Xylazine | Must be obtained under licence | ||
| Molecular Sieve | Sigma Aldrich | 208647 | Removes water from the 100 % Ethanol |
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