Eine standardisierte Methode für die Analyse von Leber sinusoidalen Endothelzellen und ihre Fenestrationen durch Rasterelektronenmikroskopie
Summary
The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.
Abstract
Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures – both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.
Introduction
Die Lebersinus Endothelzellen (LSECs) sind sehr differenzierte Endothelzellen, die die Wand des hepatischen Sinusoid auszukleiden. LSECs mit Fensteranordnungen, die nicht-blendete perforiert Poren trans 50-250 nm Durchmesser. Bis zu 20% der Oberfläche des LSECs durch Fensterungen, die üblicherweise hunderte genannten Siebböden 1-3 (Figur 1) werden in Gruppen von zehn bedeckt. Fensteranordnungen ermöglichen die Übertragung von Plasma und nanosubstrates zwischen Blut und Hepatozyten, die Schaffung eines hocheffiziente Ultrafiltrationssystem. Fensteranordnungen sind dynamische Strukturen – sowohl ihrer Größe und / oder Anzahl kann als Reaktion auf verschiedene physiologische Zustände, Drogen und Krankheit verändert werden. Zum Beispiel sind Fensterungen im nüchternen größer als im gesättigten Zustand 4; 2-Di-iodoamphetamine erhöht Fensternummer; 5,6 und eine Reduktion der Größe und Anzahl von Fensteranordnungen pro Zelle in Alterung und viele Krankheitszustände 7-13 auftritt </sup>. Genaue Messung der Größe und Anzahl von Fensteranordnungen ist wichtig für das Verständnis, wie LSEC Morphologie wird durch verschiedene Krankheiten, toxische und physiologischen Zuständen beeinflusst; ihre Auswirkungen auf die Leberfunktion; und für die Entwicklung von Fenster modulierenden therapeutischen Interventionen 1.
Das Studium der fenestrations ist schwierig. Der Durchmesser der Fensteranordnungen unterhalb der Auflösung der herkömmlichen Lichtmikroskopie, so bisher nur Beobachtung mittels Elektronenmikroskopie sowohl in intakten Lebergewebe oder Zucht LSECs möglich war. Das Rasterelektronenmikroskop (SEM) wurde am häufigsten verwendet, um Fenstergröße, die Frequenz und die Porosität (der Prozentsatz der LSEC Membran, die durch Fensterung perforiert ist) zu studieren, weil SEM ermöglicht die Beobachtung von großen Flächen der endothelialen Oberfläche und Messung von Tausenden wenn nicht Zehntausende von Fensteranordnungen. Trotz seiner Nützlichkeit, die Ergebnisse, die sich aus gemeldet werden SEM-basierte Studien fürLSEC Parameter wie Fenstergröße, die Anzahl, die Häufigkeit und die Porosität variieren weithin in der Literatur beschrieben (Tabelle 1).
Fensteranordnungen und Siebplatten sind fragile Strukturen Vertrag zu brechen, erweitern oder zusammenwachsen während der Probenvorbereitung ist somit schonende Verarbeitung benötigt, um ihre Integrität zu bewahren. Erhöhte Perfusionsdruck 14; falsche Osmolarität der Fixiermittel und Puffer 15; unzureichende Fixierung oder Fixierungszeit; und die Geschwindigkeit der Postfixierung Entwässerung und Trocknung sind alle Bereiche der Verarbeitung für SEM, die Artefakte, die mit der Erhaltung der Ultrastruktur eingreifen (Figur 2) erzeugen kann. Verlust Fensterungen ("Fenstersturz) und Fensterung Schrumpfung als Folge der schlechten Fixierung auftreten, was zu einer verringerten Durchmesser und Fensterung Zellporosität. Methoden, um den Erhalt von Proben für die REM-Analyse zu verbessern zuvor 15-17 beschrieben und diskutiert werdenhier mit zusätzlichen Tipps, wie Sie Probekonservierung zu verbessern. Die Hauptziele der Probenkonservierung sind, um Blut von der Sinusoide entfernen, so dass die Oberfläche der LSEC visualisiert und LSEC Schäden die durch Hochdruck oder verzögerte Fixierung zu vermeiden. Ganze Leberperfusion Fixiermittel über die Pfortader ist die bevorzugte Methode für Leberfixierung. Wie im Detail beschrieben, an anderer Stelle muß 16,18 Perfusion bei niedrigem Druck durchgeführt werden (beispielsweise 10 cm H 2 0) in den druckbedingten Artefakte Perfusion und Beschädigungen des LSEC vermeiden, typischerweise manifestiert sich als große Lücken in der Zellmembran. Jedoch können angemessenen Fixierung häufig mittels Nadel Perfusion von Leberbiopsien von Menschen und Tieren gewonnen werden, wie an anderer Stelle beschrieben 19. Diese Technik beinhaltet das direkte Einspritzen Fixiermittel in das Gewebe, bis Blut aus der Probe gespült und das Gewebe fest und fixiert. Fixation von Proben für die Elektronenmikroskopie braucht perf seinORMED möglichst schnell nach Beendigung des Blutflusses zu ultrastrukturelle Veränderungen als Folge der Lebern extrem schnelle autolytische Prozesse zu verhindern.
Wir stellen auch ein Verfahren zur Bildanalyse, die der Aufnahme von Artefakten minimiert, und vereinheitlicht die Messung von Fensteranordnungen. Variation bei der Auswahl der Sinuskurven für Mikroaufnahmen, Bildanalyse von Artefakten, und die Messung der Zellbereich für Porosität und Fensterfrequenz haben große Unterschiede in veröffentlichten Ergebnissen geführt. Eine Standardmethode zur Bewertung und Messung der Fensteranordnungen und der Mindestanforderungen für die Datendarstellung nicht eindeutig in der Literatur bisher 4,10,20-31 gerichtet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Fähigkeit, den Status der Lebersinus Endothel genau und reproduzierbar zu messen, ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Biologie dieser hochspezialisierten Zellen. Neuere Techniken wie strukturierte Beleuchtung Mikroskopie 32, Rasterkraftmikroskopie 33 und d-STORM (direkte Stochastic Optical Reconstrucion Microscopy) 34 wichtige Informationen vermitteln über die Morphologie dieser Zellen in vitro, aber SEM bleibt die primäre Methode zur Visualisierung und Messung…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue Number | Comments |
| EM grade Glutaraldehyde | ProSciTech | C001 | Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze |
| Paraformaldehyde powder | Sigma Aldrich | 158127 | Always prepare Paraformaldehyde fresh |
| Sodium Cacodylate powder | Sigma Aldrich | C0250 | Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016 | Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O |
| Osmium tretroxide | ProSciTech | C011 | Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle |
| Ethanol- Absolute | Sigma Aldrich | 459836 | 100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve |
| Other grades of Ethanol | Labtech | EL5 | Prepare graded Ethanols with dH2O |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 52619 | Allow to reach room temperature before use |
| Cannulas | Terumo | TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C | 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice |
| Conductive Carbon tape | ProSciTech | IA0201 | |
| Carbon Paint | ProSciTech | I003 | |
| Ketamine | Must be optained under licence | ||
| Xylazine | Must be obtained under licence | ||
| Molecular Sieve | Sigma Aldrich | 208647 | Removes water from the 100 % Ethanol |
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