Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi
Summary
The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.
Abstract
Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures – both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.
Introduction
Karaciğer sinusoidal endotelyal hücreleri (LSECs) yüksek hepatik sinusoid duvarını kaplayan endotel farklılaşmış hücrelerdir. LSECs olmayan diyaframlı olan fenestrasyonlar ile delinir, transselüler çapı 50-250 nm gözenekleri. LSECs yüzeyinin% 20 kadar elek plakalar 1-3 (Şekil 1) olarak adlandırılan yüzlerce onlarca gruplar halinde genellikle fenestrasyon, ile kaplıdır. Fenestrasyonlar bir yüksek verimli ultrafiltrasyon sistemi oluşturmak, plazma ve kan ve hepatositler arasında nanosubstrates aktarımını sağlar. Fenestrasyonlar dinamik yapıları vardır – kendi büyüklüğü ve / veya numara hem çeşitli fizyolojik devletler, uyuşturucu ve hastalığa tepki olarak değiştirilebilir. Örneğin, fenestrasyonlar tok halde 4 daha aç bırakılmış daha büyük olan; Hücre yaşlanması ve bir çok hastalık durumunda 7-13 oluşur başına 5,6 ve büyüklüğü bir azalmaya ve fenestrasyonlar sayısı; 2-di-iodoamphetamine fenestrasyon sayısını artırır </sup>. Fenestrasyonlar büyüklüğü ve sayısı doğru ölçümü LSEC morfolojisi, çeşitli hastalık, toksik ve fizyolojik devletler tarafından nasıl etkilendiğini anlamak için önemlidir; Karaciğer fonksiyon üzerindeki etkileri; ve geliştirmek için terapötik girişimlerin 1 fenestrasyonuna modüle.
fenestrasyonlar çalışma zordur. sağlam karaciğer dokusu veya kültür LSECs hem daha önce sadece gözlem kullanılarak elektron mikroskobu mümkün olmuştur bu yüzden fenestrasyonlar çapı, geleneksel ışık mikroskobu çözünürlüğü altında yatıyor. taramalı elektron mikroskobu (SEM), en sık SEM binlerce endotel yüzeyi ve ölçüm geniş alanların gözlem için sağlar, çünkü fenestrasyon boyutu, frekans ve gözeneklilik (fenestrasyon delinmiştir LSEC membran yüzdesi) incelemek için kullanılmıştır değil onlarca fenestrasyonlar binlerce eğer. Kendi programını rağmen, rapor sonuçlara yönelik çalışmalar SEM-tabanlıBu tür fenestrasyon boyut, sayı, frekans ve gözeneklilik LSEC parametreleri literatürde (Tablo 1) geniş çapta değişebilir.
Fenestrasyonlar ve elek plakaları sözleşme, kırmak dilate veya numune hazırlanması sırasında birleşme kırılgan yapılardır, bu nedenle dikkatli işleme kendi bütünlüğünü korumak için gereklidir. Artmış perfüzyon basıncı 14; Fiksatif ve tampon 15 yanlış ozmolarite; yetersiz fiksasyon veya fiksasyon süresi; ve post-fiksasyon dehidrasyon ve kurutma hızı ultrastrüktürü korunması müdahale eserler (Şekil 2) üretebilir SEM için işleme her alanlardır. Fenestrasyonlar kaybı ("Defenestration ') ve fenestrasyon çekme indirgenmiş fenestrasyon çapı ve hücre gözeneklilik ile sonuçlanır, kötü tespitin sonucu olarak meydana gelebilir. SEM analizi için numunelerin korunmasını geliştirmek için yöntemler daha önce 15-17 tarif edilmiştir ve tartışılacaktırBurada örnek korunmasını artırmak için nasıl ek ipuçları. Numune korunması temel amaçları LSEC yüzeyi görsel böylece sinüzoidler kan kaldırmak ve yüksek basınç ya da geciktirilmiş tespit birinden LSEC zarar görmesini önlemek için vardır. Portal ven yoluyla fiksatif Whole karaciğer perfüzyon karaciğer fiksasyon için tercih edilen bir yöntemdir. Detaylı olarak tarif edildiği gibi başka bir yerde 16,18 perfüzyon düşük bir basınçta yapılmalıdır (örneğin, H 2 0 10 cm) LSEC basınçla ilgili perfüzyon eserler ve zarar gelmesini önlemek için, tipik olarak, hücre membranında içinde olduğu gibi büyük boşluklar göstermiştir. Başka bir yerde 19 detaylı bir şekilde tarif edildiği gibi Bununla birlikte, makul bir sabitleme genellikle, insan ve hayvanlarda karaciğer biyopsi iğnesi perfüzyon kullanılarak elde edilebilir. Kan örneği üzerinden temizlendi kadar bu teknik, doğrudan dokuya sabitleştirici enjekte içerir ve doku sağlam ve sabitlenir. Elektron mikroskobu için örneklerin Fixation perf olması gerekirkaraciğerleri derece hızlı otolitik süreçleri sonucunda ortaya çıkan ultrastrüktürel değişiklikleri önlemek için kan akımının kesilmesini takiben mümkün olduğunca çabuk ormed.
Biz de eserler dahil en aza indirir ve fenestrasyonlar ölçümünü standartlaştıran görüntü analizi bir yöntem mevcut. Gözeneklilik ve fenestrasyon frekansı için mikrograflar için sinüzoidler seçiminde değişimi, eserlerin görüntü analizi ve hücre alanının ölçümü geçme sonuçlarını büyük farklılıklara yol açmıştır. Değerlendirilmesi ve fenestrasyonları ve veri sunumu için minimum gereksinimleri ölçümü için bir standart yaklaşım açıkça daha önce 4,10,20-31 literatürde ele alınmamıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
doğru ve tekrarlanabilir karaciğer sinüzoidal endotel durumunu ölçmek için yeteneği, bu son derece özel hücrelerin biyolojisinin anlaşılmasında önemli bir adımdır. Böyle yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu 32, atomik kuvvet mikroskobu 33 d-STORM (doğrudan Stokastik Optik Reconstrucion Mikroskopi) 34 gibi daha yeni teknikler in vitro bu hücrelerin morfolojisi hakkında önemli bilgiler vermek, ancak SEM görselleştirmek ve onların yapısını …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue Number | Comments |
| EM grade Glutaraldehyde | ProSciTech | C001 | Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze |
| Paraformaldehyde powder | Sigma Aldrich | 158127 | Always prepare Paraformaldehyde fresh |
| Sodium Cacodylate powder | Sigma Aldrich | C0250 | Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016 | Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O |
| Osmium tretroxide | ProSciTech | C011 | Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle |
| Ethanol- Absolute | Sigma Aldrich | 459836 | 100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve |
| Other grades of Ethanol | Labtech | EL5 | Prepare graded Ethanols with dH2O |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 52619 | Allow to reach room temperature before use |
| Cannulas | Terumo | TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C | 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice |
| Conductive Carbon tape | ProSciTech | IA0201 | |
| Carbon Paint | ProSciTech | I003 | |
| Ketamine | Must be optained under licence | ||
| Xylazine | Must be obtained under licence | ||
| Molecular Sieve | Sigma Aldrich | 208647 | Removes water from the 100 % Ethanol |
Riferimenti
- Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., Arias, I. M. . The Liver: Biology and Pathobiology. , 387-404 (2009).
- Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
- Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).
- Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).
- Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).
- Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).
- Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).
- Le Couteur, D. G., Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. . Calorie Restriction, Aging and Longevity. , 191-216 (2010).
- McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).
- Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).
- Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).
- Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).
- Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).
- Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).
- Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).
- Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).
- Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).
- Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).
- Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. , (2014).
- May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6 (7), e21478 (2011).
- Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).
- Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).
- Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).
- Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).
- Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).
- Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).
- Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).
- Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).
- Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).
- Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).
- Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).
