Abstract
Iskemi-Reperfusjon (IR) skade er kjent for å bidra betydelig til sykelighet og dødelighet assosiert med iskemisk slag. Iskemiske cerebrovaskulære hendelser står for 80% av alle slag. En vanlig årsak til IR skade er den hurtige innstrømningen av fluider etter en akutt / kronisk okklusjon av blod, næringsstoffer, oksygen til vevet utløser dannelsen av frie radikaler.
Hjerneinfarkt følges av blod-hjerne-barrieren (BBB) dysfunksjon og vasogenic hjerneødem. Strukturelt tett veikryss (TJS) mellom endotelcellene spiller en viktig rolle i å opprettholde integriteten av blod-hjerne-barrieren (BBB). IR skade er en tidlig sekundær skade som fører til en ikke-spesifikk, inflammatorisk respons. Oksidativt og metabolsk stress følgende betennelse utløser sekundær hjerneskade inkludert BBB permeabilitet og forstyrrelse av tett kobling (TJ) integritet.
Vår protokoll presenterer en in vitro </ Em> eksempel på oksygen-glukose deprivasjon og reoksygenering (OGD-R) på rottehjerne endotelceller TJ integritet og stress fiberdannelse. Foreløpig er flere eksperimentelle in vivo modeller brukes til å studere effekter av IR skade; men de har flere begrensninger, for eksempel de tekniske utfordringene med å utføre operasjoner, Gene avhengige molekylære påvirkninger og vanskeligheter med å studere mekanistiske relasjoner. Imidlertid kan in vitro-modeller hjelpe til med å overvinne mange av de begrensninger. Den presenterte protokollen kan brukes til å studere de forskjellige molekylære mekanismer og mekanistiske forhold for å gi potensielle terapeutiske strategier. Imidlertid kan resultatene av in vitro studier skiller seg fra standard in vivo studier og bør tolkes med forsiktighet.
Introduction
Iskemi reperfusjon (IR) skade er funnet å være den hyppigste årsaken til forskjellige ødeleggende komplikasjoner og dødsfall i forbindelse med slag, myokardialt infarkt, traume, perifer vaskulær sykdom og traumatisk hjerneskade 1,2. IR skade i cerebrale kar er en tidlig sekundærskader som fører til inflammasjon og ødem 3. En av de alvorlige komplikasjoner som oppstår som et resultat av oksidativ og metabolsk stress følgende inflammasjon er tap av homeostatisk balanse som fører til dannelse av frie radikaler, endringer i blod-hjerne-barrieren (BBB) tett veikryss (TJS) og mikrovaskulær permeabilitet 4,5.
Foreløpig in vivo modeller som brukes for å studere effekten av IR skade på BBB inkluderer midten cerebral arterie okklusjon (MCAO), microembolism og transgene eller knockout dyr. Imidlertid har hver sine ulemper og begrensninger som diskutert av Hossmann 6. MCAO modellen brukes til å studere effekts av Redox stresset, endringer i synaptiske kommunikasjon av BBB og samspillet mellom hjernen og immunceller. Men presentere de ulike tekniske utfordringer som behovet for presise mikrokirurgisk prosedyrer og vanskelighetene disse. Microembolism bryter umiddelbart ned BBB, mens bruken av transgene eller knockout dyr å studere cerebral iskemi kan ha utfordringer som gen-avhengige molekylære påvirkninger på infarktdannelse, endringer i vaskulær anatomi og ulike kroppsvekter 6. Derfor har in vitro modeller av iskemi funnet økende interesse i nyere tid hovedsakelig på grunn av deres anvendbarhet i å utføre mekanistiske studier for narkotika. Imidlertid kan resultatene av in vitro studier ikke fullt ut representerer en in vivo studier og må tolkes med forsiktighet 6.
Opphevende effekten av lave oksygenkonsentrasjoner på endotelceller cellemonolag og mikrovaskulær permeabilitet har værtstudert av Ogawa 7. Rottehjerne mikrovaskulære endotelceller (RBMECs) ble brukt til å utvikle den in vitro BBB. Oksygen-glukose deprivasjon og reoksygenering (OGD-R) teknikk som presenteres i denne protokollen er tilpasset fra studier av Zulueta et al og Zhu et al 8,9. Vi utsatte hjerne endotelceller til OGD-R ved å plassere dem i en hypoksi / anoksi kammer inneholdende 0% O 2, 5% CO2 og 95% N2. Celler ble senere vurdert for endringer i TJ integritet og stress fiberdannelse ved hjelp av immunfluorescens lokalisering og rhodamin phalloidin merking hhv. Immunfluorescens farging for zonula okkludens-en (ZO-1) blir utført for å bestemme TJ integritet, som ZO-1 er en viktig stillas membranbundet protein TJ. Rhodamine Phalloidin merking bestemmer trådformede aktin (f p-aktin) i cellen cytoskjelettet og er en klar indikasjon av aktin spenning fiberdannelse i endotelceller.
<p class = "jove_content"> Målet med denne fremgangsmåte er å gi innsikt i utviklingen OGD-R som en in vitro modell for å studere IR BBB endotelcelle TJ integritet og F-aktin spenning fiberdannelse. Resultatene vil gi informasjon om skjebnen til TJ protein, ZO-1 og stress fiberdannelse følgende OGD-R. Forstå disse sammenhengene vil gi en mulighet til å bestemme de underliggende molekylære mekanismer som utløses følgende OGD-R og utvikle potensielle terapeutiske strategier for å forbedre BBB avbrudd følgende OGD-R behandling.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Seeding av endotelceller
- Innhente primærkulturer av RBMEC er fra voksne Sprague Dawley rotter (eller få dem kommersielt).
- Dyrke RBMECs i 100 cm fibronektin (50 ug / ml) belagte petriskåler ved hjelp av rottehjernen endotelial cellevekstmedium. Endre mediet annenhver dag, inntil konfluens er nådd.
- På nå 80-90% konfluens, forsiktig vaske cellene i 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) ved å svinge. Cellene blir deretter løsnet ved å utsette dem for en ml varm 0,25% trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) løsning, ekvilibrert til 37 ° C.
- Inkuber cellene ved 37 ° C i 2-5 minutter inntil cellene er frittliggende og dispergert.
MERK: Trykk dyrkningsskålen å løsne cellene. Se celler i mikroskop for å bekrefte fullstendig løsgjøring av celler fra overflaten av fatet. - Tilsett 5 ml komplett medium til petriskålen, for å nøytralisere trypsin.Pipetter ut medium inneholdende frigjorte celler samles opp og inn i et 15 ml sentrifugerør. .
- Sentrifuger media inneholdende endotelceller ved 220 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og bevare den pellet som inneholdt cells.Suspend pelleten i 3-5 ml frisk rottehjerne endotelial cellevekstmedium ved forsiktig å blande den opp og ned med pipette Cellene blir deretter telles ved hjelp av automatisert celleteller, eller et hemocytometer.
- Overfør cellesuspensjonen til fibronektin (50 ug / ml) på forhånd belagt 8 vel sterilt kammer lysbilde system, 0,7 cm 2 / brønn med en seeding tetthet i området mellom 10,000-15,000 celler per brønn. Dyrke cellene ved 37 ° C inntil det er oppnådd konfluens
MERK: For å utføre vestlige blotter eller andre eksperimenter, kan cellene dyrkes i 10 cm cellekultur retter eller spesielle retter som kreves av eksperimentet.
2. Oksygen og Glukose deprivasjon-reoksygenering In VitroModell
MERK: Følgende protokoll er tilpasset fra Zulueta et al. 1997; H Zhu et al. 2012 8,9.
- Bruk hypoksi cellekultur system for å studere effekter av av OGD-R på RBMECs i (se figur 1). Oppsett og kalibrere hypoksi cellekultursystem før du starter forsøket, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Fjern de konfluent kammer lysbilder (trinn 1.8) fra 37 ° C inkubator. Sett på komplett medium i kammeret lysbildet med desoksydert, ingen glukose, Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) og plassert i hypoksi kammer med 95%, N 2 og 5% CO2 i 2 timer ved 37 ° C, representerer OGD tilstand.
- Flytt cellene tilbake til inkubatoren med 95% O 2, 5% CO2 ved 37 ° C og forsynt med friskt rottehjerne endotelcelle fullstendig medium og inkuberes i ytterligere 1 time ved 37 ° C.
MERK: Dette trinnet representerer en reoksygenering situasjon. - Bruk kammer lysbilder for immunfluorescens lokalisering og rhodamin phalloidin merking (se punkt 3).
3. Immunfluorescens Lokalisering av ZO-1 og f aktin merking Bruke rhodamin Phalloidin
- Expose kammer lysbilder som inneholder RBMEC monolag til 100 mL av Opti-MEM / redusert serum media / vel 1 time. Vask kammers objektglass 3 ganger i 100 ul fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,0-7,2).
- Fiksere cellene ved anvendelse av 100 ul av 4% paraformaldehyd i PBS (pH 7,0-7,2) i 15 minutter og vask kammers objektglass for tre ganger i PBS (pH 7,0-7,2).
- Permeabilisere cellene med 100 ul av 0,5% Triton X-100 i PBS, (pH 7,0-7,2) i 15 min. Blokker med 100 ul av 2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i en time. Etter dette trinnet enten flekken / label celler enten for ZO-1 eller F-aktin.
- For immunfluorescens staining inkuberes cellene med et anti-kanin primære antistoff mot ZO-1 i 1: 150, fremstilt i 2% BSA-PBS i O / N ved 4 ° C. Vask cellene tre ganger i PBS, (pH 7,0-7,2). Inkuber med 100 ul av fluoresceinisotiocyanat (FITC) -tagged anti-kanin-sekundært antistoff i 1 time ved RT.
- For Rhodamin Phalloidin merking, etter blokkering, eksponere cellene til 100 ul rhodamin phalloidin i 1:50 fortynning, utarbeidet i 2% BSA-PBS, for 20 min.
- Vask cellene fra immunfluorescens farging og rhodamin phalloidin merking i PBS, (pH 7,0-7,2). Monter kamrene ved hjelp av monterings medier som inneholder anti-fade reagent med DAPI.
- Visual cellene ved hjelp av en 60 X nedsenking i vann linse og cellene blir skannet i en enkelt optisk plan under et konfokal mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celler dyrket på fibronectin forbelagte Nunc II kammer lysbilder ble utsatt for OGD-R ved å plassere i en Biospherix ProOx modell 110 kammer. Etter å underkaste cellene til OGD-R, ble de behandlet for ZO-1 ved hjelp av immunofluoresens junctional fargingsteknikk som er vist i figur 2 og cytoskeletal montering indikerer F-aktin spenning fiberdannelse ved hjelp av rodamin phalloidin flekk etiketten som vist i figur 3. Kontrollceller som var ikke utsettes for OGD-R viste kontinuerlig junctional integritet mens endotelceller utsatt for OGD-R viste diskontinuerlige veikryss, noe som indikerer tap av TJ integritet Figur 2. Kontroll celler som ikke ble utsatt for OGD-R behandling viste ingen eller minimal f aktin stresset fiber dannelse mens endotelceller kastet OGD-R vist økte f p-aktin-spenning fiberdannelse som angir endringene i aktin cytoskeletal enheten figur 3; Rep riv ut med tillatelse fra Reference # 13
Figur 1. Vanlig konfigurasjon av Hypoksi System ProOx Modell 110. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Immunfluorescens Lokalisering av Tight Junction Protein (TJP) ZO-1 Demonstrasjon Forstyrrelse av tett veikryss følgende OGD-R i RBMECs, som vist av Hvite piler. Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Figur 3. Rhodamin Phalloidin Merking for f aktin Stress Fiber Formation Demonstrerer Endringer i cytoskeletal Assembly Etter OGD-R i RBMECs, som vist av Hvite piler. Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OGD-R som en in vitro modell for iskemi-reperfusjonsskade har blitt godt etablert for å studere neuroner 10,11. Det er også undersøkelser som viser effekten av OGD på hjerne endotelceller og endringer i permeabilitet og TJ integritet 9. Imidlertid viser vår studere effekten av OGD samt reoksygenering, som er en nærmere fremstilling av iskemisk reperfusjonsskade i in vivo-betingelser som forekommer etter iskemisk slag.
Hypoksisk-iskemisk betingelser er kjent for å indusere inflammasjon i sentralnervesystemet, som fører til BBB forstyrrelser ved å øke paracellulære permeabilitet og vasogenic ødem 4. Reperfusjonsskade er et meget sammensatt og dynamisk prosess, hvor det er overdreven produksjon av reaktive oksygenforbindelser, ATP tømming, økning i ekstracellulære kalium, frigjøring av eksitatoriske nevrotransmittere, endotelceller og neuronal hevelse, immuncelleaktivering. Dette i sin tur causes aktivering av forskjellige inflammatoriske baner, hvilket fører til cytokinproduksjon, induksjon av nukleaser og proteaser, noe som fører til ødem, som alle er vist å aktivere forskjellige caspaser, som fører til avbrudd av BBB integritet 5,12. Endotelceller er spesielt utsatt for iskemisk skade, på grunn av tilstedeværelsen av et stort antall mitokondria. De nærliggende endotelceller er knyttet til hverandre ved hjelp av tett veikryss vedlikeholdes av stramme koblings proteiner.
ZO-1 er vist å spille en viktig rolle i å opprettholde TJ integritet ved interaksjonen med andre proteiner og stramme koblings aktin cytoskeletal forsamlingen. Dessuten er viktig for mange utviklingsmessige og fysiologiske prosesser, inkludert celle-celle adhesjon presis regulering av aktin cytoskjelettet. I endotelceller, er actin spenning fiberdannelse funnet å være assosiert med barriere dysfunksjon og hyperpermeabilitetsprosesser 13,14. Rhodamin phalloiDIN merkingsteknikk som brukes i den foreliggende studie for å observere f-actin spenning fiberdannelse er et sluttpunkt studien. Imidlertid kan dynamisk og levende avbildning av stress fiberdannelsen også utføres som vist ved Doggett og Breslin 15.
Den aktuelle studien understreker majorly bidraget fra ZO-en mot BBB tight junction integritet. Imidlertid kan andre trange koplings molekyler som claudin-5, occludin, synaptiske adhesjonsmolekyler (JAM) osv også anvendes som markører for å studere BBB stramme koblings integritet følgende OGD-R. I denne studien anvendte vi immunfluorescens lokalisering og F-aktin merking som en kvalitativ teknikk for å bestemme den stramme koblings integritet. Men vi kan også studere andre viktige kjennetegn ved BBB som kvantitativ måling av permeabilitet ved hjelp av fluorescerende markører og transendothelial elektrisk motstand (Teer).
Den OGD-R teknikk presenteres i denne studien brukerBiospherix system kan bare brukes for hypoksi / anoksi studier ved en fast konsentrasjon av oksygen; Imidlertid kan vi ikke benytter dette systemet for å studere effekten av varierende konsentrasjoner av oksygen på endotelceller. For å studere effekten av varierende konsentrasjoner av oksygen på endotelceller trenger vi å anvende andre tilgjengelige modeller som er egnet for formålet.
Denne teknikken kan brukes til å studere de mekanistiske forhold mellom forskjellige cellulære og molekylære hendelser som regulerer BBB hyperpermeabilitetsprosesser og TJ integritet. Forstå dem vil gi innsikt for utvikling av ulike molekylære strategier for å dempe BBB avbrudd og mikrovaskulær permeabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi erkjenner Scott and White Hospital Stipend Program for økonomisk støtte og Texas A & M Health Science Center College of Medicine Integrert Imaging Laboratory for bruk av konfokal laser mikroskop. Vi erkjenner Mr. Glen Cryer for å få hjelp med manuskriptet redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A.
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
