Abstract
Ischemi-reperfusion (IR) skada är känd för att väsentligt bidra till sjuklighet och dödlighet i samband med ischemisk stroke. Ischemiska cerebrovaskulära olyckor står för 80% av alla slag. En vanlig orsak till IR-skada är den snabba inflödet av fluider efter en akut / kronisk tilltäppning av blod, näringsämnen, syre till vävnaden utlöser bildandet av fria radikaler.
Ischemisk stroke följs av blod-hjärnbarriären (BBB) dysfunktion och vasogent hjärnödem. Strukturellt tight junctions (TJs) mellan endotelcellerna spelar en viktig roll för att upprätthålla integriteten i blod-hjärnbarriären (BBB). IR-skada är en tidig sekundär skada som leder till ett icke-specifikt, inflammatoriskt svar. Oxidativ och metabolisk stress efter inflammation utlöser sekundära hjärnskador inklusive BBB permeabilitet och störningar av täta fogar (TJ) integritet.
Vår protokoll visar en in vitro </ Em> exempel på syre glukos deprivation och syresättningen (OGD-R) på råtthjärna endotelcell TJ integritet och stressfiberbildningen. För närvarande är flera experimentella in vivo-modeller som används för att studera effekterna av IR-skada; men de har flera begränsningar, såsom de tekniska utmaningarna i att utföra operationer, gen beroende molekylära influenser och svårigheter att studera mekanistiska relationer. Emellertid kan in vitro-modeller stöd för att övervinna många av dessa begränsningar. Den presenterade protokollet kan användas för att studera de olika molekylära mekanismer och mekanistiska relationer för att ge potentiella terapeutiska strategier. Dock kan resultaten av in vitro-studier skiljer sig från standard in vivo-studier och bör tolkas med försiktighet.
Introduction
Ischemi-reperfusion (IR) skada visar sig vara den vanligaste orsaken till olika försvagande komplikationer och dödsfall i samband med stroke, hjärtinfarkt, trauma, perifer kärlsjukdom och traumatisk hjärnskada 1,2. IR skada i cerebrala kärl är en tidig sekundär skada som leder till inflammation och ödem 3. En av de allvarliga komplikationer som uppstår som en följd av oxidativ och metabolisk stress efter inflammation är förlust av homeostatiska balansen som leder till bildning av fria radikaler, förändringar i blod-hjärnbarriären (BBB) tight junctions (TJs) och mikrovaskulär permeabilitet 4,5.
För närvarande in vivo-modeller som används för att studera effekterna av IR skada på BBB inkluderar mitten cerebral artärocklusion (MCAO), mikroemboli, och transgena eller knockout djur. Dock har varje sina nackdelar och begränsningar som diskuteras av Hossmann 6. MCAO modell används för att studera den effekts av redoxstress, förändringar i Junktional meddelanden från BBB och samspelet mellan hjärnan och immunceller. Men presenterar de olika tekniska utmaningar som behovet av precisa mikro förfaranden och de svårigheter däri. Mikroemboli bryter omedelbart ned BBB medan användningen av transgena eller knockout djur för att studera cerebral ischemi kan ha utmaningar som gen beroende molekylära påverkan på infarktbildning, förändringar i vaskulär anatomi och varierande kroppsvikt 6. Därför har in vitro modeller av ischemi hittades ökat intresse på senare tid främst på grund av deras användbarhet för att utföra mekanistiska studier för droger. Dock kan resultaten av in vitro-studier är helt representativ en in vivo-studie och måste tolkas med försiktighet 6.
Motverkande effekt av låga syrehalter på endotelceller cellmonoskikt och mikrovaskulär permeabilitet har varitstuderas av Ogawa 7. Råtthjäma mikrovaskulära endotelceller (RBMECs) användes för att utveckla in vitro BBB. Den syre glukos deprivation och syresättningen (OGD-R) teknik som presenteras i detta protokoll har anpassats från studier av Zulueta et al och Zhu et al 8,9. Vi exponerade hjärn endotelceller till OGD-R genom att placera dem i en hypoxi / anoxi kammare innehållande 0% O 2, 5% CO2 och 95% N2. Celler senare bedömas för förändringar i TJ integritet och stress fiberbildningen med hjälp av immunofluorescens lokalisering och rodamin falloidin märkning respektive. Immunofluorescens färgning för zonula occludens-1 (ZO-1) utförs för att bestämma TJ integritet, såsom ZO-1 är ett viktigt ställningsmembranbundet TJ-proteinet. Rodamin Phalloidin märkning bestämmer fintrådiga aktin (f-aktin) i cellen cytoskelettet och är en tydlig indikation på aktin stressen fiberbildning i endotelceller.
<p class = "jove_content"> Målet med denna metod är att ge insikt i att utveckla OGD-R som en in vitro IR modell för att studera BBB endotelceller TJ integritet och f-aktin stressen fiberbildningen. Resultaten kommer att ge information om vad som hänt TJ protein, ZO-1 och stress fiberbildning efter OGD-R. Att förstå dessa relationer kommer att ge en möjlighet att avgöra de underliggande molekylära mekanismer som utlöses efter OGD-R och utveckla potentiella terapeutiska strategier för att förbättra BBB störningar efter OGD-R behandling.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sådd av endotelceller
- Skaffa primära kulturer av RBMEC s från vuxna Sprague Dawley (eller få dem kommersiellt).
- Odla RBMECs i 100 cm fibronektin (50 | ig / ml) belagda petriskålar med användning av råtthjärna endotelcelltillväxt medium. Ändra medium var två dagar, tills konfluens uppnås.
- För att nå 80-90% konfluens, försiktigt tvätta cellerna i 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom att snurra. Cellerna stryks sedan loss genom att exponera dem för en ml varm 0,25% trypsin- etylendiamintetraättiksyra (EDTA) -lösning, jämviktade till 37 ° C.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i 2-5 min tills cellerna lösgörs och dispergeras.
OBS: Tryck kulturen skålen för att lossa cellerna. Se celler under mikroskop för att bekräfta fullständig lösgöring av cellerna från ytan av skålen. - Tillsätt 5 ml fullständigt medium i petriskålen för att neutralisera trypsin.Pipettera ut mediet innehållande lösgjorda celler och samla in den i en 15 ml centrifugrör. .
- Centrifugera medier innehållande endotelceller vid 220 xg under 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och bevara pellet innehållande cells.Suspend pelleten i 3-5 ml färskt råtthjärna endotelcell tillväxtmedium genom att försiktigt blanda det upp och ned med pipett Celler kommer att sedan räknas med användning av automatiserad cellräknare eller en hemocytometer.
- Överför cellsuspensionen till fibronektin (50 | ig / ml) förbelagda 8 väl sterilkammaren glidsystem, 0,7 cm 2 / brunn med en såddtäthet som sträcker sig mellan 10.000-15.000 celler per brunn. Odla cellerna vid 37 ° C tills konfluens uppnås
OBS: För att utföra Western-läskningar eller andra experiment, kan celler odlas i 10 cm cellodlingsskålar eller speciella rätter som krävs av experimentet.
2. Syre och glukos Deprivation-ny syresättning In VitroModell
OBSERVERA: Följande protokoll har anpassats från Zulueta et al., 1997; Zhu H et al. 2012 8,9.
- Använd hypoxi cellodlingssystem för att studera effekterna av av OGD-R på RBMECs i (se figur 1). Installation och kalibrera hypoxi cellodlingssystem innan försöket, enligt tillverkarens anvisningar.
- Ta bort sammanflytande kammarglas (steg 1,8) från 37 ° C inkubator. Ersätt det kompletta mediet i kammaren sliden med deoxygenerat, att ingen glukos, Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) och placerades i hypoxi kammare med 95%, N2 och 5% CO2 under 2 h vid 37 ° C, representerar OGD-tillstånd.
- Flytta cellerna tillbaka till inkubator med 95% O2, 5% CO2 vid 37 ° C och försedd med färsk råtthjäma endotelcell komplett medium och inkubera under ytterligare 1 h vid 37 ° C.
OBS: Detta steg innebär en ny syresättning situation. - Använd kammar bilder för immunofluorescens lokalisering och rodamin falloidin märkning (se avsnitt 3).
3. Immunofluorescens Lokalisering av ZO-1 och f-aktin märkning Använda Rodamin Phalloidin
- Exponera kammarobjektglas innehållande RBMEC monoskikt till 100 pl av opti-MEM / reducerad serummedier / brunn under en timme. Tvätta kammarobjektglasen tre gånger i 100 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,0 till 7,2).
- Fixera cellerna med användning av 100 pl av 4% paraformaldehyd i PBS (pH 7,0 till 7,2) under 15 minuter och tvätta kammarobjektglasen i 3 gånger i PBS (pH 7,0 till 7,2).
- Permeabilisera celler med användning 100 pl av 0,5% Triton X-100 i PBS, (pH 7,0 till 7,2) under ytterligare 15 minuter. Blockera med 100 pl av 2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS under en timme. Efter detta steg antingen fläck / etikett celler antingen ZO-1 eller f- aktin.
- För immunfluorescens staining inkubera cellerna med en anti-kanin-primär antikropp mot ZO-1 i ett: 150, framställd i 2% BSA-PBS för O / N vid 4 ° C. Tvätta cellerna 3 gånger i PBS, (pH 7,0 till 7,2). Inkubera med 100 pl av fluorescein isotiocyanat (FITC)-märkt anti-kanin sekundär antikropp under 1 timme vid RT.
- För rodamin Phalloidin märkning, efter blockering, exponera cellerna till 100 pl av rodamin phalloidin i 1:50 utspädning, framställd i 2% BSA-PBS, under 20 minuter.
- Tvätta cellerna från immunofluorescensfärgning och rodamin phalloidin märkning i PBS (pH 7,0-7,2). Montera kamrarna med hjälp av monterings media innehållande anti-fade reagens med DAPI.
- Visualisera cellerna med hjälp av en 60 X nedsänkning i vatten lins och celler skannas i en enda optisk plan under ett konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celler odlade på fibronektin förbelagda Nunc II kammare diabilder utsattes för OGD-R genom att placera i en Biospherix ProOx modell 110 kammare. Efter att utsätta celler för OGD-R, var de beredda för ZO-1 Junktional färgning med användning av immunofluorescens-teknik, såsom visas i fig 2 och cytoskelettala aggregat indikerar F-aktin spänningsfiberbildning med användning av rodamin falloidin fläck etikett såsom visas i fig 3. Kontrollceller som var inte utsätts för OGD-R visade kontinuerlig Junktional integritet medan endoteliala celler som utsatts för OGD-R visade diskontinuerliga korsningar, vilket indikerar förlust av TJ integritet Figur 2. Kontrollceller som inte utsattes för OGD-R-behandling uppvisade ingen eller minimal f-aktin-spänningsfiber bildning medan endoteliala celler som utsatts för OGD-R visat någon ökad f-aktin spänningsfiberbildning som anger förändringar i aktin cytoskelettala aggregatet Figur 3; Rep rint med tillstånd från referens # 13
Figur 1. Typisk konfiguration av Hypoxi System ProOx Model 110. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Immunofluorescens Lokalisering av täta fogar protein (TJP) ZO-1 Demonstrera Störning av de täta förbindelserna efter OGD-R i RBMECs, vilket framgår av vita pilar. Skala bar = 10 nm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Rodamin Phalloidin Märkning för f-aktin Stress fiberbildning Demonstrera Förändringar i cytoskeletal församling Efter OGD-R i RBMECs, vilket framgår av vita pilar. Skala bar = 10 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OGD-R som en modell in vitro för ischemi-reperfusionsskada har väl etablerad för att studera nervceller 10,11. Det finns också studier som visar effekten av OGD på hjärn endotelceller och förändringar i permeabilitet och TJ integritet 9. Emellertid visar vår studie effekten av OGD liksom ny syresättning, vilket är en närmare representation av ischemisk reperfusionsskada i in vivo-betingelser som förekommer efter ischemisk stroke.
Hypoxiska-ischemiska betingelser är kända för att inducera inflammation i centrala nervsystemet, vilket leder till BBB störningar genom att öka paracellulär permeabilitet och vasogent ödem 4. Reperfusionsskada är en mycket komplex och dynamisk process, där det är överproduktion reaktiva syreradikaler, ATP utarmning, stiga i extracellulärt kalium, frigörande av excitatoriska neurotransmittorer, endotel och nerv svullnad, immuncellsaktivering. Detta i sin tur causes aktivering av olika inflammatoriska vägar, som leder till cytokinproduktion, induktion av nukleaser och proteaser, vilket leder till ödem, vilka alla är visade för att aktivera olika caspaser, vilket leder till störning av BBB-integritet 5,12. Endotelceller är speciellt benägna att ischemisk skada, på grund av närvaron av stora antal mitokondrier. De angränsande endotelceller är länkade till varandra genom tight junctions som upprätthålls av täta fogar proteiner.
ZO-1 har visat sig spela en viktig roll för att upprätthålla TJ integritet genom dess interaktion med andra täta fogar proteiner och aktin cytoskelettala enheten. Dessutom är en förutsättning för många utvecklings- och fysiologiska processer, inklusive cell-cell sammanväxningar exakt reglering av aktincytoskelettet. I endotelceller, är aktin spänningsfiberbildning visat sig vara associerade med barriärdysfunktion och hyperpermeabilitet 13,14. Rodamin phalloidin-märkningsteknik som används i föreliggande studie för att observera f-aktin spänningsfiberbildning är en slutpunkt studie. Emellertid kan också utföras dynamisk och levande avbildning av stressfiberbildning såsom visas av Doggett och Breslin 15.
Den aktuella studien understryker majorly bidrag ZO-1 mot BBB täta fogar integritet. Emellertid kan andra täta fogar molekyler såsom claudin-5, occludin, junctionala adhesionsmolekyler (JAM) osv också användas som markörer för att studera BBB täta fogar integritet efter OGD-R. I denna studie använde vi immunofluorescens lokaliseringen och f-aktin märkning som en kvalitativ teknik för att bestämma den täta fogar integritet. Men vi kan också studera andra viktiga egenskaper hos BBB som kvantitativ mätning av permeabilitet med hjälp av fluorescerande markörer och transendotelial elektrisk resistans (TEER).
Den OGD-R-teknik som presenteras i denna studie med hjälp avBiospherix systemet kan endast användas för hypoxi / anoxi studier vid en bestämd koncentration av syre; emellertid kan vi inte använda detta system för att studera effekten av varierande koncentrationer av syre på endotelceller. För att studera effekterna av olika koncentrationer av syre på endotelceller behöver vi använda andra tillgängliga modeller som är lämpliga för ändamålet.
Denna teknik kan användas för att studera mekanistiska relationer mellan olika cellulära och molekylära händelser som reglerar BBB hyperpermeabilitet och TJ integritet. Förstå dem kommer att ge insikt för att utveckla olika molekylära strategier för att dämpa BBB störningar och mikrovaskulär permeabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi erkänner Scott and White Hospital forskningsbidrag Program för ekonomiskt stöd och Texas A & M Health Science Center College of Medicine Integrerad Imaging Laboratory för användning av den konfokala lasermikroskop. Vi erkänner Mr Glen Cryer för att få hjälp med manus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A.
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
