Abstract
Ischémie-reperfusion (IR) des blessures est connu pour contribuer de manière significative à la morbidité et de la mortalité associée à un accident ischémique cérébral. Accidents vasculaires cérébraux ischémiques représentent 80% de tous les accidents vasculaires cérébraux. Une cause fréquente de blessures IR est l'afflux rapide de liquides suite à une occlusion chronique / aiguë de sang, les nutriments, oxygène vers les tissus déclenchant la formation de radicaux libres.
L'AVC ischémique est suivie par barrière hémato-encéphalique (BHE) et la dysfonction vasogénique oedème cérébral. Structurellement, les jonctions serrées (TJS) entre les cellules endotheliales jouent un rôle important dans le maintien de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE). IR blessure est une blessure secondaire au début conduisant à une réponse inflammatoire non spécifique. Le stress oxydatif et l'inflammation métabolique suivante déclenche des dommages au cerveau secondaire comprenant perméabilité de la BHE et la perturbation des jonctions serrées (TJ) intégrité.
Notre protocole présente in vitro </ Em> exemple de la privation d'oxygène-glucose et réoxygénation (AM-R) sur des cellules de cerveau de rat endothéliale TJ intégrité et la formation de fibres de stress. Actuellement, plusieurs expérimentale dans des modèles in vivo sont utilisés pour étudier les effets des blessures IR; mais ils ont plusieurs limitations, telles que les difficultés techniques liées à des opérations chirurgicales, les influences moléculaires dépendantes de gènes et la difficulté à étudier les relations mécanistes. Cependant, les modèles in vitro peuvent aider à surmonter bon nombre de ces limitations. Le protocole présenté peut être utilisé pour étudier les différents mécanismes moléculaires et les relations mécaniques à fournir des stratégies thérapeutiques potentielles. Cependant, les résultats des études in vitro peuvent différer de la norme des études in vivo et doivent être interprétées avec prudence.
Introduction
Ischémie-reperfusion (IR) des blessures se trouve être la cause fréquente de diverses complications et de décès débilitants associés à l'AVC, infarctus du myocarde, un traumatisme, une maladie vasculaire périphérique et une lésion cérébrale traumatique 1,2. Blessures IR dans les vaisseaux cérébraux est une blessure secondaire au début conduisant à une inflammation et un oedème 3. Une des complications graves qui se produisent à la suite de stress oxydatif et l'inflammation métabolique qui suit est la perte de l'équilibre homéostatique conduisant à la formation de radicaux libres, des altérations de la barrière hémato-encéphalique (BHE) jonctions serrées (TJ) et la perméabilité microvasculaire 4,5.
Actuellement, des modèles in vivo utilisées pour étudier les effets des blessures IR sur le BBB inclure une occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO), microembolies et transgéniques ou knock-out animaux. Cependant, chacun a ses inconvénients et limitations comme indiqué par Hossmann 6. Modèle MCAO est utilisée pour étudier l'effits de stress redox, changements dans les communications de jonction de la BHE et les interactions entre le cerveau et les cellules immunitaires. Cependant, ils présentent divers défis techniques tels que la nécessité de procédures de microchirurgie précis et les difficultés qui y sont. Microembolies rompt instantanément sur le BBB tandis que l'utilisation de transgéniques ou knock-out animaux pour étudier l'ischémie cérébrale peut avoir des défis tels que les influences génétiques moléculaires dépendant sur la formation de l'infarctus, les changements dans l'anatomie vasculaire et variabilité de poids corporel 6. Ainsi, des modèles in vitro d'ischémie ont trouvé un intérêt croissant ces derniers temps principalement en raison de leur applicabilité dans la réalisation d'études mécanistes pour les médicaments. Cependant, les résultats des études in vitro peuvent ne pas représenter pleinement une étude in vivo et doivent être interprétées avec prudence 6.
Réactives effet de faibles concentrations d'oxygène sur des monocouches de cellules endotheliales et la perméabilité microvasculaire étéétudié par Ogawa 7. Les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de rat (RBMECs) ont été utilisés pour développer in vitro du Bureau. La privation et la réoxygénation oxygène-glucose (OGD-R) technique présentée dans ce protocole a été adapté à partir d'études de Zulueta et al et Zhu et al 8,9. Nous avons exposé les cellules endotheliales du cerveau à OGD-R en les plaçant dans une chambre de l'hypoxie / anoxie contenant 0% O 2, 5% CO 2 et 95% de N 2. Les cellules ont ensuite été évalués pour des altérations de l'intégrité et le stress TJ formation de fibres par immunofluorescence localisation et la rhodamine étiquetage phalloidin respectivement. Immunofluorescence pour zonula occludens-1 (ZO-1) est effectuée pour déterminer l'intégrité TJ, comme ZO-1 est une membrane d'échafaudage importante protéine liée à TJ. Étiquetage rhodamine phalloïdine détermine l'actine filamenteuse (f actine) dans le cytosquelette de la cellule et est une indication claire de l'actine la formation de fibres de stress dans les cellules endothéliales.
<p class = "jove_content"> Le but de cette méthode est de donner un aperçu de l'élaboration OGD-R comme un modèle in vitro de IR pour étudier BBB intégrité de TJ de cellules endothéliales et la formation de fibres de stress f-actine. Les résultats fourniront des informations sur le sort de la protéine TJ, ZO-1 et la formation de fibres de stress suivant OGD-R. La compréhension de ces relations sera l'occasion de déterminer les mécanismes moléculaires sous-jacents qui sont déclenchés suivent OGD-R et développer des stratégies thérapeutiques potentielles pour améliorer la perturbation BBB après le traitement AMG-R.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. L'ensemencement des cellules endothéliales
- Obtenir des cultures primaires de RBMEC de partir adultes rats Sprague-Dawley (ou de les obtenir dans le commerce).
- Cultiver RBMECs à 100 cm de la fibronectine (50 ug / ml) des boîtes de Petri revêtues en utilisant le milieu de croissance des cellules endothéliales de cerveau de rat. Changer le milieu tous les deux jours, jusqu'à confluence est atteint.
- En arrivant à 80-90% de confluence, laver délicatement les cellules dans 5 ml tampon phosphate salin (PBS) par tourbillonnement. Les cellules sont ensuite détachés en les exposant à 1 ml de trypsine acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) solution chaude de 0,25%, équilibrée à 37 ° C.
- Incuber les cellules à 37 ° C pendant 2-5 min jusqu'à ce que les cellules sont décollées et dispersés.
REMARQUE: Appuyez sur la boîte de culture pour détacher les cellules. Voir les cellules sous le microscope pour confirmer le détachement complet de cellules de la surface de la boîte. - Ajouter 5 ml médias complet à la boîte de Pétri afin de neutraliser la trypsine.Pipeter le milieu contenant les cellules détachées et les recueillir dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. .
- Centrifuger les médias contenant des cellules endothéliales à 220 g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et de préserver le culot contenant cells.Suspend le culot dans 3-5 milieu de croissance des cellules endothéliales de cerveau de rat ml fraîche en mélangeant doucement de haut en bas avec des cellules de pipettes seront alors comptés en utilisant un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre.
- Transférer la suspension cellulaire dans la fibronectine (50 ug / ml) prérevêtue 8 système chambre de coulissement puits stérile, 0,7 cm 2 / puits avec une densité de semis comprise entre 10.000-15.000 cellules par puits. Cultiver les cellules à 37 ° C jusqu'à ce que la confluence est atteinte
REMARQUE: Pour effectuer des transferts Western ou d'autres expériences, les cellules peuvent être cultivées dans 10 cm des boîtes de culture cellulaire ou des plats spéciaux tel que requis par l'expérience.
2. oxygène et de glucose Privation-réoxygénation In VitroModèle
REMARQUE: Le protocole suivant a été adapté à partir de Zulueta et al. 1997; Zhu H et al. 2012 8,9.
- Utilisez le système de culture cellulaire à l'hypoxie pour étudier les effets de d'autres ministères-R sur RBMECs dans (voir Figure 1). Le programme d'installation et de calibrer le système de culture cellulaire à l'hypoxie avant de commencer l'expérience, selon les instructions du fabricant.
- Retirez les diapositives de la chambre de confluence (étape 1.8) à partir de la 37 ° C incubateur. Remplacer le milieu complet dans la glissière de la chambre avec désoxygénée, aucun glucose, milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) et placé dans la chambre de l'hypoxie avec 95% de N 2 et 5% de CO 2 pendant 2 h à 37 ° C, pour représenter l'état OGD.
- Déplacez les cellules de retour à l'incubateur avec 95% de O 2, 5% de CO 2 à 37 ° C et muni d'un cerveau de rat cellules endothéliales milieu complet frais et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
NOTE: Cette étape représente une situation de réoxygénation. - Les diapositives de la chambre pour immunofluorescence localisation et l'étiquetage de la rhodamine phalloïdine (voir section 3).
3. immunofluorescence localisation de ZO-1 et f étiquetage actine Utilisation rhodamine phalloïdine
- Exposer les diapositives de la chambre contenant des monocouches RBMEC 100 pi de milieu Opti-MEM / sérique réduite / puits pendant 1 heure. Laver les lames de la chambre 3 fois dans 100 ul de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,0 à 7,2).
- Fixer les cellules en utilisant 100 pi de paraformaldehyde à 4% dans du PBS (pH 7,0 à 7,2) pendant 15 min et laver les lames creuses pour 3 fois dans du PBS (pH 7,0 à 7,2).
- Perméabiliser les cellules en utilisant 100 ul de 0,5% de Triton X-100 dans du PBS, pH (7,0 à 7,2) pendant 15 min. Bloquer avec 100 ul de 2% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS pendant une heure. Après cette étape soit des cellules tache / étiquette soit pour ZO-1 ou f- actine.
- Pour immunofluorescence staining incuber les cellules avec un anticorps primaire anti-lapin contre ZO-1 en 1: 150, établi en 2% de BSA-PBS pour O / N à 4 ° C. Laver les cellules trois fois dans du PBS (pH 7,0-7,2). Incuber avec 100 ul de la fluorescéine isothiocyanate (FITC) -tagged anticorps secondaire anti-lapin pendant 1 heure à température ambiante.
- Pour le marquage rhodamine phalloïdine, après blocage, exposer les cellules à 100 pi de la rhodamine phalloïdine en dilution 1:50, préparé dans 2% de BSA-PBS, pendant 20 min.
- Laver les cellules d'immunofluorescence et la rhodamine étiquetage phalloïdine dans du PBS (pH 7,0-7,2). Montez les chambres en utilisant les médias de montage contenant un réactif anti-fade avec DAPI.
- Visualisez les cellules en utilisant un 60 X eau lentille à immersion et les cellules sont analysés dans un plan optique unique sous un microscope confocal.
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Representative Results
Les cellules cultivées sur des lames fibronectine de chambre Nunc II prérevêtus ont été soumis à d'autres ministères-R en plaçant dans un modèle 110 chambre Biospherix ProOx. Après avoir soumis les cellules à OGD-R, ils ont été traités pour ZO-1 jonctionnelle coloration en utilisant une technique d'immunofluorescence comme représenté sur la figure 2 et l'assemblage du cytosquelette indiquant la F-actine la formation de fibres de stress en utilisant la rhodamine phalloïdine étiquette aux taches comme représenté sur la Figure 3. Les cellules témoins qui étaient non soumis à OGD-R ont montré l'intégrité de jonction continue tandis que les cellules endothéliales soumises à OGD-R ont montré jonctions discontinues, indiquant la perte de l'intégrité TJ Figure 2. cellules de contrôle qui ne sont pas soumis à des traitements OGD-R ont montré peu ou pas de f fibres de stress actine formation tandis que les cellules endothéliales soumises à OGD-R f ont démontré une augmentation formation de fibres de stress d'actine indiquant les changements dans le cytosquelette d'actine assemblage la figure 3; Reps rimer avec la permission de référence n ° 13
Figure 1. Configuration typique du modèle hypoxie système ProOx 110. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Localisation des immunofluorescence Tight Junction Protein (TJP) ZO-1 Démontrer perturbation des jonctions serrées suivantes OGD-R dans RBMECs, comme indiqué par les flèches blanches. La barre d'échelle = 10 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. rhodamine phalloïdine étiquetage pour f Formation actine contraintes de la fibre Démontrer changements dans Assemblée cytosquelette Après OGD-R dans RBMECs, comme indiqué par les flèches blanches. La barre d'échelle = 10 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
OGD-R comme un modèle in vitro pour les lésions d'ischémie-reperfusion a été bien établi pour étudier les neurones 10,11. Il existe également des études montrant l'effet de l'OGD sur les cellules et les modifications endothéliales cérébrales de la perméabilité et l'intégrité TJ 9. Cependant, notre étude montre l'effet de l'OGD ainsi que réoxygénation, qui est une représentation plus proche de lésions de reperfusion ischémique dans des conditions in vivo qui se produisent suite à un AVC ischémique.
conditions hypoxiques-ischémiques sont connus pour induire l'inflammation dans le système nerveux central, ce qui conduit à rupture de la BHE par augmentation de la perméabilité paracellulaire et l'oedème vasogénique 4. les lésions de reperfusion est un processus très complexe et dynamique, dans laquelle il ya une production excessive d'espèces réactives de l'oxygène, de l'épuisement de l'ATP, l'élévation du potassium extracellulaire, la libération de neurotransmetteurs excitateurs, endothéliale et un gonflement neuronale, l'activation des cellules immunitaires. Ceci, à son tour, causes activation de diverses voies inflammatoires, conduisant à la production de cytokines, l'induction de proteases et des nucleases, ce qui conduit à un oedème, qui sont représentés à activer différentes caspases, ce qui conduit à la rupture de l'intégrité du Bureau 5,12. Les cellules endotheliales sont particulièrement sujettes à une lésion ischémique, en raison de la présence d'un grand nombre de mitochondries. Les cellules endotheliales voisines sont reliés les uns aux autres par des jonctions serrées maintenues par des protéines de jonctions serrées.
ZO-1 est disponible pour jouer un rôle important dans le maintien de l'intégrité TJ par son interaction avec les autres protéines de la jonction serrée et l'assemblage du cytosquelette d'actine. En outre, la réglementation précise de cytosquelette d'actine est essentiel pour de nombreux processus physiologiques et de croissance, y compris adhérences cellule-cellule. Dans les cellules endotheliales, l'actine la formation de fibres de stress est trouvée être associée à une dysfonction de la barrière et l'hyperperméabilité 13,14. Rhodamine phalloidin technique d'étiquetage utilisées dans la présente étude pour observer la formation de fibres de stress f-actine est une étude de point final. Cependant, l'imagerie dynamique et en temps réel de la formation de fibres de stress peut également être effectuée comme indiqué par Doggett et Breslin 15.
L'étude actuelle met l'accent sur la contribution de majorly ZO-1 en direction de l'intégrité des jonctions serrées Bureau. Cependant, d'autres molécules telles que des jonctions serrées claudine-5, occludine, des molécules d'adhésion jonctionnelle (JAM), etc., peuvent également être utilisés comme marqueurs pour étudier l'intégrité des jonctions serrées Bureau suivant OGD-R. Dans cette étude, nous avons utilisé immunofluorescence localisation et l'étiquetage f-actine comme une technique qualitative pour déterminer l'intégrité des jonctions serrées. Cependant, nous pouvons également étudier les autres caractéristiques importantes de la BBB comme mesure quantitative de la perméabilité à l'aide de marqueurs fluorescents et résistance électrique transendothéliale (TEER).
La technique OGD-R présenté dans cette étude en utilisant leBiospherix système ne peut être utilisé pour des études d'hypoxie / anoxie à une concentration fixe de l'oxygène; Cependant, nous ne pouvons pas employer ce système pour étudier l'effet des concentrations d'oxygène variable sur les cellules endothéliales. Pour étudier les effets de différentes concentrations d'oxygène sur les cellules endothéliales nous avons besoin d'employer d'autres modèles disponibles adaptés à cet effet.
Cette technique peut être utilisée pour étudier les relations entre les différents mécanistes événements cellulaires et moléculaires qui régulent BBB hyperperméabilité et l'intégrité TJ. Pour les comprendre, donnera un aperçu de l'élaboration de diverses stratégies moléculaires pour atténuer rupture de la BHE et la perméabilité microvasculaire.
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Acknowledgments
Nous reconnaissons Scott et le Programme de subventions de recherche Hôpital Blanche pour un soutien financier et Texas A & M Health Science Center College de médecine de laboratoire intégré Imaging pour l'utilisation du microscope confocal à balayage laser. Nous reconnaissons M. Glen Cryer de l'aide pour l'édition de manuscrits.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
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