Abstract
I recenti progressi nell'applicazione delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMMSC) per il trattamento di lesioni legamentose e tendinee nel cavallo suggeriscono una migliore misure di esito in entrambi gli studi sperimentali e clinici. Sebbene la BMMSC vengono impiantati nella lesione tendinea in gran numero (di solito 10 - 20 milioni cellule), solo un numero relativamente piccolo sopravvivere (<10%) anche se questi possono persistere per 5 mesi dopo l'impianto. Questo sembra essere un comune osservazione in altre specie dove BMMSC sono stati impiantati in altri tessuti ed è importante capire quando si verifica questa perdita, quanti sopravvivono il processo di impianto iniziale e se le cellule vengono cancellati in altri organi. Il monitoraggio del destino delle cellule può essere ottenuto mediante radiomarcatura il BMMSC prima dell'impianto che permette non invasivo imaging in vivo di posizione di cella e la quantificazione dei numeri di cellulare.
Questo protocollo descrive un labeli cellulareProcedura ng che usa tecnezio-99m (Tc-99m), e il monitoraggio di queste cellule dopo l'impianto in tendini flessori feriti nei cavalli. Tc-99m è un (t 1/2 del 6,01 hr) isotopo breve durata che emette raggi gamma e può essere internalizzati dalle cellule in presenza del hexamethylpropyleneamine ossima composto lipofilo (HMPAO). Queste proprietà lo rendono ideale per l'uso in cliniche di medicina nucleare per la diagnosi di molte malattie differenti. Il destino delle cellule marcate può essere seguita a breve termine (fino a 36 ore) per la scintigrafia gamma di quantificare sia il numero di cellule conservate nella lesione e distribuzione delle cellule nei polmoni, tiroide e altri organi. Questa tecnica è adattato dall'etichettatura di leucociti del sangue e può essere utilizzato per l'immagine impiantato BMMSC in altri organi.
Introduction
Strategie rigenerativa per la riparazione di tessuti malati o danneggiati sono basate su cellule staminali multipotenti derivate da una varietà di tessuti e impiantati nella zona colpita. I recenti progressi nell'applicazione delle autologo BMMSC per il trattamento di tendini e lesioni legamentose nel cavallo hanno dimostrato di migliorare le misure di outcome sia sperimentale 1-5 e studi clinici 6. Il cavallo è un modello particolarmente interessante per valutare l'efficacia delle cellule staminali trattamenti correlati perché soffre di età e affaticare le lesioni riportate ai tendini dell'arto anteriore distale, è un animale atletico, ed è un grande, facilitare il recupero del midollo osseo e dell'impianto corretto. Lesioni tendinee guarire naturalmente con fibrosi ma il tendine è guarito funzionalmente inferiore 7 e ha un elevato rischio di re-infortunio 8. Il superficiale tendine flessore (SDFT) è più comunemente influenzato come si è evoluto per agire come una energia elasticanegozio ed esperienze ad alto carico insiste per ottenere efficienza energetica e locomozione ad alta velocità. Ripristinare la funzione dopo la lesione è quindi fondamentale. Queste lesioni sono simili a quelle che interessano il tendine di Achille nell'uomo che svolge una funzione simile 9. Non ci sono buone opzioni di trattamento per curare o raggiungere un buono di riparazione per tali lesioni, strategie rigenerative quindi basati su cellulari offrono un'opportunità interessante per migliorare i risultati e ridurre re-infortunio.
Nella maggior parte degli studi 5 - 20 milioni BMMSC autologhe vengono iniettati direttamente nella lesione che solitamente si verificano nel nucleo del corpo tendine che agisce quindi come un ricettacolo per le cellule. Il destino delle cellule, una volta iniettate non è chiaro e metodi diversi di etichettatura delle cellule per monitorare le cellule sono state descritte recentemente. Cellule marcate con un cartellino di fluorescenza hanno dimostrato di sopravvivere solo in un numero relativamente piccolo (<10%) 10,11. Etichette fluorescenza richiedonotessuto extraction e sezionamento per l'analisi istologica, che richiede molto tempo e non facilmente facilitare l'analisi temporale in un grande modello animale o in casi clinici. Nel più recente lavoro abbiamo usato il 99m Tc radioisotopi per etichettare le cellule e seguire il loro destino da Gamma scintigrafia 1. Questo metodo consente raffronti rapidi da effettuare tra le diverse vie di consegna delle cellule, tra cui intralesionale, per via endovenosa attraverso la vena giugulare 1 o perfusione regionale via intra-arteriosa di 12 o per via endovenosa 1,12 iniezioni. La persistenza e la distribuzione di cellule possono poi essere ripreso dalla gamma scintigrafia dei vari organi. Questo ha dimostrato che solo il 24% delle cellule iniettate intralesionally rimasto nella lesione da 24 ore 1 e questo è supportato da un altro studio utilizzando lesioni sperimentalmente creati e utilizzando lo stesso radiomarcato 5. Inoltre, le cellule mostrano una limitata capacità di casa in lesioni tendinee quando consegnato neld per perfusione regionale o per via endovenosa, ma sono dispersi nei polmoni di questi ultimi percorsi 4.
BMMSC etichettato con nanoparticelle di ferro è un metodo alternativo per monitorare le cellule impiantate in tendini delle zampe anteriori 13. Sebbene cellule marcate nanoparticelle ferro consentono inseguimento cellule in vivo tramite MRI, studi temporali in un grande animale sono limitati dal numero di volte in anestesia possono essere somministrati ad ogni tempo per effettuare le scansioni MRI. Inoltre, le nanoparticelle di ferro sono ipointensa in MRI che limita le informazioni sulla migrazione di cellule marcate nel corpo tendine. Altri radioisotopi che possono essere utilizzati comprendono indio-111 ma soffre lo svantaggio di un tempo di dimezzamento più lungo di Tc-99m (2,8 giorni vs 6,0 ore) e più alta energia di emissione di raggi gamma. Inoltre, la vitalità cellulare è stata riportata una riduzione quando marcato con Indio-111 14. Tc-99m, d'altra parte, viene normalmente utilizzato sia nucleare equina e umanamedicina di etichettare cellule mononucleate del sangue periferico e seguire la loro distribuzione in vivo mediante scintigrafia. Esso può essere relativamente facilmente assimilato dalle cellule utilizzando HMPAO come una molecola linker di impegnare la tecnezio, come Tc-99m-HMPAO, alle cellule. Tc-99m-HMPAO etichettato BMMSC mostrano buona vitalità e può proliferare in vitro 4. Dettagli Questo protocollo l'etichettatura e la tracciabilità dei equino BMMSC autologo impiantato in lesioni viventi naturalmente allo SDFT zampa anteriore.
È importante notare che il protocollo è destinato esclusivamente per essere utilizzato come strumento di ricerca. Il suo uso come modalità terapeutica clinica non è raccomandata come l'effetto del radiomarcato sul fenotipo cellulare non è stato completamente chiarito.
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Protocol
I casi descritti nel presente documento sono stati eseguiti seguente autorizzazione etico concessa dal Etica e il benessere Comitato degli animali del Colegio de VETERINARIOS de Malaga, in Spagna, e il Royal Veterinary College, North Mymms, Regno Unito Le procedure utilizzate sui cavalli si basano su protocolli approvati che sono usato in clinica per i cavalli che ricevono terapie basate sulle cellule staminali, che comprende la sedazione, l'aspirazione del midollo osseo, iniezione intra-tendinee, perfusione regionale, iniezione endovenosa, il trattamento e la gestione del dolore post-procedurale e il monitoraggio dopo l'impianto.
1. Disposizioni chiave per essere fatte in anticipo
- Cercate etica istituzionali e l'approvazione del benessere degli animali e di aderire ai requisiti di legge locali prima di iniziare il lavoro.
- Chiedere l'approvazione istituzionale di lavorare con radiazioni ionizzanti come dettato dalle normative locali e legali, tra cui il livello di protezione del personale e dell'ambiente e lo smaltimento di contamrifiuti inato.
- Utilizzare i seguenti criteri di inclusione: i cavalli presenti con un infortunio strapazzo non traumatica (tendinopatia o desmopathy) al flessore superficiale tendine digitale dell'arto anteriore e lesioni con conseguente difetto entro il tendine e il difetto è circondato da tendine e / o paratenonio intatto .
Nota: L'esame e la diagnosi di tali infortuni e la preparazione clinica dei cavalli per l'impianto delle cellule è stato dettagliato altrove 6,15.
Nota: L'isolamento e l'espansione in coltura di BMMSC derivate dal midollo osseo dei cavalli è stato dettagliato in precedenza 6,16. L'attuale protocollo per l'iniezione di BMMSC per lesioni SDFT nel cavallo utilizza 10 milioni di cellule per ml 4 di midollo surnatante osso autologo (BMS) 16. - Utilizzare le cellule che hanno subito non più di 4 passaggi per l'impianto in vivo di evitare potenziali fenotipo cellulare o alterazioni genetiche associate con il numero elevato passaggio cells.
- Fornire il numero di celle nella BMS richiesta (entro 24 ore in una scatola a freddo 4 - 8 ° C) alla clinica veterinaria dove l'impianto di cellule deve essere eseguita.
Nota: L'uso clinico delle cellule staminali mesenchimali nel midollo osseo surnatante è una procedura brevettata di proprietà di ReCellerate Inc (USA) e il suo uso può richiedere l'autorizzazione.
Nota: Tc-99m è un emettitore gamma (140 keV) con un relativamente breve emivita (6,0058 ore, quindi il 94% decade alla sua forma stabile di 99 Tc in 24 ore). L'energia di gamma lo rende adatto per il rilevamento da telecamere gamma (scintigrafia) ed i risultati a breve emivita nel tempo l'esposizione alle radiazioni molto limitato sia per il cavallo e il personale di gestione degli animali. Questo protocollo descrive l'etichettatura in loco di cellule utilizzando Tc-99m-HMPAO [HMPAO marcato con Tc-99m (come pertecnetato di sodio)]. - Ordinare il Tc-99m fresco direttamente presso tale che essa è stata utilizzata per l'etichettatura e la cellule ingegnohin 2 ore di eluizione del generatore Tc-99m. Assicurarsi che il Tc-99m è fornita come 1 GBq a (tampone standard del fornitore) un 1 ml di soluzione.
- Utilizzare tutti i tamponi a temperatura ambiente. Eseguire la procedura di etichettatura, l'impianto delle cellule e di imaging (gamma scintigrafia) in una camera di contenimento isotopo con tutte le attrezzature puliti con alcool asciuga prima dell'inizio dei lavori.
2. Preparazione del Cavallo e Ecografia dell'arto anteriore tendine
- Registra scansioni a ultrasuoni in un primo ricovero per infortunio (quando il midollo osseo viene aspirato) e poi al punto di tempo quando le cellule vengono iniettate radioattivi.
- Eseguire l'ecografia e l'impianto delle cellule con il cavallo che porta peso uniformemente in una stalla e sotto sedazione in piedi (piuttosto che l'anestesia generale). Somministrare sedazione usando una miscela di detomidina HCl e butorfanolo tartrato, ciascuna a 0.01 al 0.02 mg / kg IV.
Nota: Il recupero è rapido e post-chirurgica di trattamento non richiedeconsiderazioni particolari. - Dopo l'anestesia perineurale è applicato (passo 2,6) nella dell'arto interessato, tenere il cavallo alla stazione sotto sedazione per ridurre il movimento del cavallo durante il trattamento. Controllare visivamente il livello appropriato di sedazione giudicati dalla posizione di testa abbassata e il comportamento del cavallo e che il cavallo è comodo durante l'iniezione di cellule e i movimenti della gamma camera durante l'acquisizione delle immagini scintigrafiche.
Nota: Non è necessario applicare veterinario pomata sugli occhi (per prevenire la secchezza) perché sotto sedazione lampeggiante non viene modificata e il cavallo è in grado di mantenere l'idratazione degli occhi. Il monitoraggio dopo l'impianto delle cellule non è invasivo (ultrasuoni e gamma scintigrafia). - Fermaglio da vicino i capelli sovrastante il tendine (con tosatrici cavallo) quindi pulire l'area ritagliata utilizzando una combinazione di uno scrub chirurgico clorexidina e, infine, l'alcool.
- Applicare gel di accoppiamento acustico per la zona eeseguire la scansione metodicamente per registrare scansioni della regione completo palmare metacarpo, i livelli in sequenza etichettati 1 - 7 17, con un trasduttore lineare (12 MHz o simile) per ottenere seriale coincidenza trasversali e longitudinali immagini. Conservare le immagini digitalmente in modo che l'area della sezione trasversale e la zona lesioni massimo 4 possono essere ottenuti con l'ausilio di software di analisi di immagine.
- Preparare zona sovrastante le nervi palmari immediatamente distale del carpo per iniezione asettiche di anestetico locale per garantire la completa desensibilizzazione della pelle sovrastante il tendine e il tendine flessore superficiale. Iniettare 2 ml di mepivicaine sia per via sottocutanea e adiacente ai nervi palmari (nella loro posizione sub-fasciale) tra i tendini flessori e il legamento sospensorio immediatamente distale del carpo su entrambi i lati dell'arto.
- Una volta che la scansione preliminare è stata eseguita la preparazione del sito di impianto lavando la zona con clorexidina s chirurgicheSoluzione crub per almeno 5 minuti e, infine, con una garza imbevuta di alcool. Eseguire tutti i passaggi successivi in modo asettico.
3. Tc-99m-etichettatura di cellule staminali mesenchimali Equine
Nota: I passaggi di etichettatura delle cellule possono essere eseguite durante l'ecografia dell'arto anteriore come questo decadimento isotopo minimizzerà tra l'etichettatura delle cellule e l'impianto di cellule marcate nel tendine.
- Rimuovere il BMS dalle cellule poiché interferisce con l'assorbimento di isotopo. Per fare questo, recuperare il flaconcino di BMMSC (10 milioni di cellule in 1 ml di BMS) dalla scatola freddo e agglomerare le cellule in una microcentrifuga a 350 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione il surnatante con un 18G o 19G ago (attaccato ad una siringa da 2 ml), lasciando una piccola goccia (≤ 0,1 ml) nel tubo per aiutare la risospensione delle cellule. Salvare il surnatante (BMS) in una provetta sterile e tenere in ghiaccio per dopo il riutilizzo.
- Risospendere le cellule in gocciolina residua di surnatante da flIcking il tubo delicatamente con le dita (piuttosto che vortex) e lasciare la provetta in un rack a temperatura ambiente. Assicurarsi che le cellule sono risospese completamente e che non ci siano grumi di cellule visibili.
- Preparare il Tc-99m come segue. Trasferire 1 ml di tecnezio pertecnetato in una fiala di HMPAO utilizzando una siringa da 1 ml e l'ago. Mescolare delicatamente ma accuratamente e lasciar riposare per 5 minuti dietro piombo schermatura. Nota: Questo passaggio può essere fatto mentre le cellule girano al punto 2.1.
- Aggiungere tutta la miscela Tc-99m-HMPAO utilizzando una siringa da 1 ml e l'ago per le cellule e mescolare delicatamente. Incubare per 30 minuti a RT dietro piombo schermatura.
- Per i passi successivi, utilizzare una pinza (o un foglio di carta velina) per aprire il coperchio della provetta per minimizzare la contaminazione isotopo del pollice (guanto) e successivamente altre attrezzature. Usare una siringa da 2 ml e 21 ago G per aggiungere o rimuovere il tampone di lavaggio.
Nota: L'uso di un monitor campo isotopo viene incoraggiato a monitorare la contaminazione delle superfici e attrezzature. Aggiungere 1 ml di PBS alla miscela Tc-99m-HMPAO-cellule, chiudere il coperchio, mescolare delicatamente e girare per far sedimentare le cellule come al punto 3.1. - Rimuovere con attenzione il PBS in una nuova provetta (salvare questo dietro il piombo schermatura ed etichetta come W1). Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS fresco. Centrifugare il tubo e rimuovere il surnatante come sopra (salvare questo ed etichetta come W2).
- Calcolare l'efficienza di etichettatura misurando i conteggi in tubi W1 e W2 e il pellet di cellule. A tale scopo, mettendo ciascuno tubi in uno strumento calibratore di dose isotopo Bene e registrare la radioattività come colpi per minuto (CPM). Calcolare l'efficienza etichettatura (Radioattività come CPM di celle) / (Radioattività delle cellule + surnatante) x 100.
- Risospendere le cellule a fondo nel residuo PBS e quindi aggiungere il BMS salvato dal punto 3.1. Le cellule sono pronte per l'impianto intralesionale.
4. L'impianto di celle Tc-99m-HMPAO marcati
- L'impianto intralesionalenel tendine sotto guida ecografica
- Lentamente introdurre un pollice 1.5 o 2 (50 mm) 20 ago G nella zona massima pregiudizio della lesione in un orientamento longitudinale con il trasduttore ad ultrasuoni, coperto da un telo sterile, in linea con l'ago in modo che la lunghezza dell'ago può essere identificati ecograficamente e la punta se l'ago si trova esattamente al centro della lesione.
- Utilizzando appropriata schermatura, raccogliere le cellule in una siringa da 2 ml (Luer-lock, per ridurre al minimo il rischio di contaminazione esterna e in un coprisiringa piombo schermatura) utilizzando un ago G 20. Gettare l'ago facendo attenzione a non perdere alcun fluido. Ora collegare la siringa con le cellule marcate l'ago pre-situato nel tendine.
- Posizionare la sonda ecografica sotto l'ago in modo che il tratto dell'ago nel tessuto è chiaramente visibile. Iniettare le cellule ad un ritmo lento ma costante nella lesione. Assicurarsi che non c'è resistenza a iniezione. Se questo si verificariposizionare accuratamente l'ago sotto guida ecografica. Controllare che l'espulsione del fluido nella lesione è visibile l'immagine ecografica come fluido contenente bolle d'aria anecoica iperecogeni on.
- Togliere l'ago e collocare immediatamente la pressione sul foro dell'ago per evitare la perdita di cellule iniettate e minimizzare la diffusione isotopo sulla superficie esterna del lembo. Vestire Immediatamente l'arto con uno strato di fasciatura autoadesivo. Il cavallo è pronto per la scintigrafia gamma. Eseguire questo immediatamente.
Nota: Dopo aver iniettato le cellule nel tendine, acquisire un conteggio del siringa vuota e l'ago per valutare la possibile perdita diretta di cellule che possono rimanere nella siringa.
- Perfusione regionale di cellule Tc-99m-HMPAO marcati
- Seguire passo 2.4.
- Applicare un 100 millimetri laccio emostatico di gomma benda sul metacarpo prossimale con due 100 millimetri rotolo di garza di cotone fasciatura posizionato mediale e laterale.
- Asetticamente preparare °e pelle sopra la vena digitale palmare laterale a livello della laterale prossimale osso sesamoide lavando la zona con una soluzione di clorexidina scrub chirurgico per almeno 5 minuti e infine con garza imbevuta di alcool. Eseguire tutti i passaggi successivi in modo asettico.
- Preparare una estensione 100 millimetri set con un 21 G x ¾ "(0,8 x 19 mm) ago a farfalla per venipuntura riempiendo con soluzione salina sterile eparinizzata e quindi introdurre l'ago nella vena laterale digitale palmare. Sangue Una volta inserita la vena sarà parzialmente riempire il set di estensione. Al connettore a bloccaggio Luer allegare un tappo di gomma blocco Luer per facilitare la successiva iniezione di cellule marcate.
- Diluire le cellule staminali mesenchimali in 19 ml di PBS raccogliendo le cellule in una siringa da 20 ml precaricato con il PBS. Applicare le cellule attraverso la coppa di gomma con un 18 G (1,2 x 40 mm) ago ipodermico ad un tasso lento ma costante (30 - 40 sec). Lavare il catetere con 1 ml di PBS precaricati in una Syringe.
- Rimuovere l'ago e immediatamente applicare pressione alla pelle sopra il foro dell'ago con uno strato di cinque 4 x 4 garze di cotone. Poi posto un bendaggio adesivo elastico leggero con sopra la zona sesamoide prossimale e lasciare il laccio emostatico in posizione per 30 minuti dopo l'iniezione.
- Rilasciare il laccio emostatico dopo 30 min. Il cavallo è pronto per la scintigrafia gamma.
Nota: Dopo aver iniettato le cellule, acquisire un conteggio del siringa vuota e l'ago per valutare la possibile perdita diretta di cellule che possono rimanere nella siringa.
5. Gamma Scintigrafia
- Immagini scintigrafia
- Acquisire immagini planare scintigrafia con gamma camera (fissato a 140 KeV picco fotoelettrico utilizzando una finestra simmetrica 20%) dotato di una bassa energia, foro collimatore parallelo.
- Ottenere tutte le immagini dopo tempo 0 su cavalli sedati come al punto 2.2 in piedi. Dopo il tempo 0 scintigrafia, sostituire la benda luce sopra la si dell'impiantoTé con una benda imbottita. Rimuovi questa benda prima di ogni esame la scintigrafia.
- Acquisire immagini statiche per 60 secondi ciascuno (256 da 256 matrice) utilizzando il software di elaborazione con la "acquisizione" - "Selezione di studio" - opzioni "osso statiche". È essenziale che il cavallo non si muove durante il periodo di acquisizione dell'immagine perché l'opzione modalità statica non ha un modulo per la correzione di movimento.
- Per l'iniezione intralesionale, ottenere immagini laterali dalla zona della lesione da carpo all'estremità distale, l'area equivalente dell'arto controlaterale, il campo polmone sinistro e la tiroide sinistra. Durante l'acquisizione di immagini arti anteriori, posizionare uno schermo di piombo tra le gambe per evitare l'imaging del controlaterale dell'arto. Acquisire le immagini a 5 min dopo l'iniezione (tempo 0), e poi a 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 48 ore.
- Per perfusione regionale, ottenere immagini laterali e dorsale gamma come ad 5.1.1.3. Ottenere immagini 5 min after rilascio laccio emostatico. Questo sarà tempo 0. Può essere utile l'arto immagine immediatamente dopo l'iniezione delle cellule di valutare conteggi precedenti del laccio rilascio. Ottenere immagini gamma a 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 48 ore dopo la somministrazione delle cellule.
- Dopo che le immagini sono state acquisite, processo le immagini utilizzando manualmente l'opzione "trasformazione" del software con le opzioni selezionate per il colore "Sokoloff" e colore "Inverti". Quindi seleziona la "regione di interesse" (ROI) e "ellisse" come questo permette rimodellamento della maschera di selezione e circolazione sull'area lesione. Ottenere i conteggi sul ROI scegliendo l'opzione "aggiungi le statistiche". Garantire che le regioni in modo identico di dimensioni di interesse (ROI) sono registrate per ogni animale ai diversi punti temporali.
- Successivamente, correggere i conteggi per il decadimento prevista del tecnezio in ogni punto. Utilizzare la seguente equazione per correggere decadimento:A = A o e - (0.693t / T 1/2), dove A o l'attività iniziale dell'isotopo, A è il decadimento corretto radioattività al tempo zero, t è il tempo trascorso e T 1/2 è la metà -life dell'isotopo. Poi esprimere i conteggi corretti in ogni punto temporale come percentuale della ROI al tempo 0 per elaborare la percentuale di cellule rimanenti, utilizzando la seguente formula:
- Acquisire immagini planare scintigrafia con gamma camera (fissato a 140 KeV picco fotoelettrico utilizzando una finestra simmetrica 20%) dotato di una bassa energia, foro collimatore parallelo.
% di cellule rimanenti (t) = 100 - {[(decadimento predetto (t) - decadimento (t)) / decadimento predetto (t)]} x 100
decadimento (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.
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Representative Results
Tc-99m-HMPAO incorporazione in BMMSs non compromettere la loro capacità di aderire alla cultura del tessuto plastico e mentre mostrano capacità proliferazione di formare monostrati (figura 1), non abbiamo pienamente determinato se i tassi di proliferazione o altri fenotipi cellulari sono interessati. La loro morfologia è simile alle cellule non marcate con una tipica forma a fuso. L'efficienza etichettatura cellulare (es., L'assorbimento di etichetta) varia tipicamente da circa 1,5% al 25%. La ragione principale per la bassa efficienza di etichettatura è stato legato al ritardo nella consegna del 99m Tc alla clinica dal luogo in cui il generatore di Mo-99 / Tc-99m è stato eluito. Ritardi di oltre 2 ore si traducono in un consistente calo di etichettatura delle cellule. Tuttavia, isotopo sufficiente è incorporato nelle cellule per eseguire la scintigrafia gamma fino a 36 ore (Figura 2). I fattori che possono migliorare l'efficienza di etichettatura sono dettagliate nella discussione.
1 (direttamente nella lesione) o mediante perfusione regionale via digitale vena o arteria 1 12. Impiantazione intralesionale è possibile quando la lesione è nel nucleo del tendine e circondato da tendine tessuto intatto che funge da ricettacolo per le cellule. Perfusione regionale è una via più facile da amministrare le celle in cui vengono iniettate in un vaso sanguigno, ma il metodo si basa sull'aspettativa che le cellule staminali mesenchimali sono in grado di "casa-in" per la lesione tendinea. Ci sono prove limitate che le MSC possono specificatamente casa all'interno di siti o di lesioni tendinee ma questo metodo fornisce un approccio sperimentale utile per lo sviluppo di applicazioni che possono aumentare la capacità di homing delle cellule staminali mesenchimali.
Con il percorso di consegna intralesionale, le cellule saranno visti come una zona focale di segnale che rimane relativamente localizzato con il tempo cioè., C'è s limitatipread o migrazione delle cellule nel tessuto tendineo circostante. Al contrario, ci sarà una graduale riduzione di segnale con il tempo nel sito di iniezione quando le cellule vengono somministrati mediante perfusione regionale attraverso la vena palmare digitale (Figura 2). È comune con iniezione intralesionale per campi polmonari come negativo ma in alcuni casi nei punti di tempo molto precoce polmone possono mostrare segnale isotopo che può essere focale e quindi diventa più generalizzato (Figura 3). La tiroide resta negativo con questa via di somministrazione. Perfusione regionale simile può mostrare segnale focale nei polmoni che diventa più diffuso, ma il segnale è significativamente più intensa rispetto a quella osservata con il percorso intralesionale. La tiroide può spesso mostrano anche il segnale focale.
Il conteggio iniziale radioisotopi totale di cellule (tempo 0, pre-iniezione) e la conta della scintigrafia gamma iniziale della regione di interesse (tempo 0, dopo i-njection), sono noti e utilizzati per calcolare la percentuale di diminuzione della conta ad ogni tempo. Questo è utilizzato per confrontare al decadimento prevista del Tc-99m dai conteggi iniziali (Figura 4). La curva calcolata seguirà la curva prevista. Tuttavia, dopo aver preso il decadimento predetto conto, la persistenza di cellule rimanenti nel sito di iniezione dopo la somministrazione intralesionale è di circa 32% (a 12 ore) e 24% (a 24 ore) (Figura 4).
Figura 1. Etichettatura delle cellule, iniezione e Gamma scintigrafia (A) Trasferimento di BMMSC in una microcentrifuga prima marcatura con Tc-99m-HMPAO dietro piombate schermatura (schermo e supporto siringa) e il monitor radiazioni e microcentrifuga.; (B) Un'aliquota di cellule marcate Tc-99m-HMPAO seminate in una coltura di tessuti piatto spettacolo buono morphology, la vitalità e la proliferazione; (C) L'iniezione di cellule Tc-99m-HMPAO etichettati sotto guida ecografica nel sito della lesione del diritto forelimb SDFT; (D) Gamma scintigrafia dell'arto anteriore. La gamma camera è posizionata precisamente utilizzando un braccio idraulico maneggevole e ogni potenziale etichettati cellule dell'arto controlaterale sono eliminati da uno scudo piombo tenuta tra le gambe. La gamma camera è posizionata in modo simile al petto per monitorare il campo di polmone o al collo per monitorare il campo di tiroide. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. ultrasuoni e Gamma scintigrammi del SDFT. Tipici ultrasonographs dell'arto anteriore alla regione medio-metacarpale in (A (B) sezione trasversale. La lesione nel SDFT si vede chiaramente come un'area ipoecogena (verso la parte superiore della scansione) rispetto al (normale) l'integrità del tessuto indenne del tendine flessore profondo (DDFT) adiacente e sotto la SDFT. L'area della lesione e le posizioni relative dei tendini sono raffigurati nello schema qui sotto. Scintigraphs Gamma eseguiti a 3, 6 e 12 ore dopo l'iniezione di cellule radiomarcati sono indicati per le cellule iniettate (C) nella lesione o (D) per via endovenosa perfusione regionale tramite il palmare vena digitale. Nel caso mostrato, c'era assorbimento di cellule radiomarcati nel sito della lesione SDFT (frecce solidi). Persistenza di assorbimento da parte della vena digitale palmare è indicata dalla freccia tratteggiata. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Gamma scintigrammi del polmone e tiroide. Scansioni tipiche da punti temporali primi sono indicati sia per l'iniezione intralesionale e perfusione regionale di cellule marcate. Si noti la focale e il segnale diffuso nei campi polmonari e tiroidei. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. decadimento della radioattività registrati dalla Regioni di interesse dopo l'iniezione intralesionale. In questo cavallo, i conteggi sono stati misurati da scintigrammi gamma della SDFT oltre 36 ore dopo l'iniezione nella lesione. Pannello sinistro: la radioattività in ogni punto è stato calcolato rispetto al valore di tempo 0. Poidecadimento atural in radioattività di 99m Tc è mostrato per il confronto. A destra: la percentuale stimata di cellule rimanenti. Questo viene calcolato dal livello di radioattività dalle regioni di interesse. In questo caso la restante percentuale di cellule a 24 ore era di circa 24%. Abbiamo effettuato questo protocollo (etichettatura di MSC e impianto) su 21 cavalli. Prego clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Oltre al midollo osseo, cellule staminali isolate da fonti come il tessuto adiposo sono adatti per l'etichettatura con questo protocollo. Inoltre, le cellule da uno stato congelato può essere ripreso e ampliato in coltura per i numeri desiderati per gli studi di etichettatura 12.
Un fattore critico che determina l'efficienza di etichettatura del BMMSC è il tempo tra eluizione del Tc-99m dal generatore di molibdeno al radiofarmacia, preparazione di Tc-99m-HMPAO e l'uso del radiofarmaco nella clinica. Esiste una relazione inversa tra efficienza etichettatura e dopo 99m Tc-eluizione dal generatore tale che i ritardi oltre questo periodo possono compromettere significativamente l'efficienza della marcatura delle cellule. Pertanto, è necessario uno stretto coordinamento tra la consegna delle cellule dal laboratorio e la consegna del Tc-99m alla clinica il giorno in cui le cellule saranno radiomarcato e impiantato. Il tempo di trasporto al clinic è quindi un fattore importante. La scheda tecnica del fornitore specificare che il decadimento del Tc-99m riduce la purezza della radiochimica dopo 2 ore post-eluizione che possono interferire con il legame del HMPAO al Tc-99m e, successivamente, la quantità di Tc-99m-HMPAO preso dalle cellule. Abbiamo anche notato che l'etichettatura di cellule in coltura in un ambiente di laboratorio ha dato l'etichettatura più efficiente che in clinica. Questo ha anche segnalato da un altro studio in cavalli 5 dove le cellule sono state marcate in un ambiente di laboratorio. Inoltre, nella nostra esperienza, etichetta viene assorbita più efficiente dalle cellule che sono etichettati immediatamente dopo la preparazione di campioni di sangue o di tessuti rispetto alle cellule preparate dalla cultura. Tuttavia, anche con bassa efficienza di etichettatura è sufficiente etichetta legata alle cellule per eseguire scintigrafia oltre 36 hr.
Etichettatura efficienze del 40% - 80% possono essere realizzati per leucociti se il Tc-99m è utilizzato da unfresco eluato generatore entro 30 minuti e la reazione eseguita in un piccolo volume (1 - 0,5 ml) 18. Etichettatura efficienze di 47% - 71% sono stati raggiunti per equino MSC 19 dimostrando che è possibile aumentare l'efficienza etichettatura delle cellule staminali mesenchimali in condizioni ideali.
Noi abitualmente impiantiamo 20 milioni di cellule per il trattamento delle lesioni principali SDFT anche fino a 40 milioni di cellule sono state impiantate per maggiori lesioni. Un numero simile di cellule potrebbe essere impiantata tramite perfusione regionale anche se questo metodo non è comunemente utilizzato per la procedura più complessa. Tuttavia, può essere utile per le lesioni che si estendono alla periferia della superficie tendine con l'aspettativa che cellule sufficiente sede nella lesione. Monitoraggio delle cellule gamma scintigrafia può fornire informazioni utili sul movimento delle cellule somministrate per vie diverse. In questo protocollo, le cellule impiantate per via intralesionale sono Mostly mantenuto al sito di iniezione per via intralesionale. Segnale Radioisotope può osservare nei campi polmonari in alcuni casi, ma risulta in generale che c'è poca migrazione delle cellule dal sito della lesione. Consegna di BMMSC mediante perfusione regionale suggerisce che ci possono essere ritenzione delle cellule nel sito di lesione, ma quando consegnato da iniezione endovenosa 4 non abbiamo osservato homing delle cellule. L'etichetta Tc99m-HMPAO non influenza la capacità di migrazione delle cellule 20 e, come Tc-99m-HMPAO è internalizzato dalle cellule e trattenuto nel citoplasma, è improbabile che interferisca con proprietà di adesione.
Il calcolo del segnale da regioni di interesse può essere una sottostima in quanto è possibile che che ci possono essere significativa dissociazione dell'etichetta da cellule (rilasciato dalle cellule morte o altri meccanismi di rilascio di cellule vive). La tiroide cattura isotopo gratuito (Tc-99m) rilasciata dalle cellule morte o morenti, e Tc-99m-HMPAO può essere eliminata dai reni e intestino. Questi tessuti possono essere monitorati da gamma scintigrafia per valutare la potenziale perdita di etichetta.
La procedura di etichettatura cella può essere adattato per testare la conservazione delle cellule e l'assorbimento in vari siti (organi e lesioni) utilizzando diversi percorsi di consegna. La natura focale del segnale nei polmoni può essere indicativo di aggregati di cellule che presumibilmente rompono con il tempo o entrano lisi cellulare. La tiroide, che cattura isotopo gratuito, presumibilmente evidenzia un incremento di captazione dopo perfusione regionale perché le cellule iniettate e detriti risultanti da cellule morte hanno un percorso più accessibile alla tiroide attraverso la circolazione. Anche se solo circa il 24% delle cellule rimangono dopo 24 ore, il percorso intralesionale nel tendine è il percorso di consegna più efficace quanto la maggior parte dei casi non hanno mostrato alcuna connessione Tc-99m nella tiroide. Le informazioni ottenute da utilizzare tali protocolli può informare futura progettazione e sviluppo di applicazioni delle cellule staminali per more efficaci terapie cliniche.
Il protocollo di etichettatura delle cellule è stato adattato per l'uso del cavallo dall'etichettatura Tc-99m-HMPAO di leucociti nelle applicazioni mediche umane. Il suo utilizzo in questo protocollo dimostra applicabilità in un grosso animale in cui la malattia si verifica spontaneamente tendine per le indagini di terapie a base di cellule. Il reclutamento di casi clinici può aiutare a compensare i maggiori costi associati a lavorare con un animale più grande. La procedura di etichettatura per l'uso come una modalità di imaging è stato descritto in piccoli modelli animali 21 e crediamo che il protocollo può analogamente essere utilizzato in animali più grandi, come la pecora per ricerche di altre malattie tendinee.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 hr of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18 G and 19 G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18 G); NN1938R (19 G) | |
| Syringes 1 ml and 2 ml | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
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