Isolatie en cultuur van de Adult zebravis Brain-afgeleide Neurosferen
Summary
Hier hebben wij een reproduceerbare werkwijze voor volwassenen neurogenese onderzocht onder toepassing van een assay neurosphere afgeleid van de gehele hersenen of van ofwel de telencephalic, tectal of cerebellaire gebieden van de volwassen hersenen zebravis. Daarnaast beschrijven we de procedure om genexpressie te manipuleren in zebravis neurosferen.
Abstract
The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.
Introduction
Zoogdieren neurale stamcellen (NSC's) zijn gekarakteriseerd in vitro door hun vermogen te groeien in vrij zwevende clusters culturen van delende cellen genoemd neurosferen 1. In aanwezigheid van epidermale groeifactor (EGF) en fibroblast groeifactor (FGF), NSC splitsen hetzij symmetrisch zelf-vernieuwing NSC's genereren of asymmetrisch twee dochtercellen te genereren, bijv., Een differentiërende progenitor cel en een nieuwe NSC. Neurosfeerculturen derhalve een mengsel van neurale stam / voorlopercellen en gedifferentieerde neurale cellen NSCs 2-4 kan echter worden onderscheiden van andere celtypen neurosfeer door twee specifieke eigenschappen. Ze langdurig zelfvernieuwing weergegeven in vrij- zwevende culturen en ze kunnen differentiëren naar alle neurale cellijnen (dat wil zeggen, neuronen, astrocyten en oligodendrocyten) na intrekking van groeifactoren en extracellulaire matrix hechting aan substraten. in Mammals het neurosfeercultuur systeem als eerste in vitro systeem gebruikt om de aanwezigheid van NSC in de volwassen hersenen tonen en blijft de meest gebruikte middel om proliferatie, zelfvernieuwingscapaciteit en multipotent van neurale stamcellen en voorlopercellen te analyseren. Zelfs al bol vormende assays lijden aan een aantal nadelen en beperkingen 4 Dit kweeksysteem is waardevol voor het beoordelen van het potentieel van een cel te gedragen als een stamcel wanneer uit de in vivo niche 4 verwijderd en is behulpzaam geweest bij het identificeren sleutelregulatoren van NSC zelfvernieuwing en cel lot bepalen 5-7.
In tegenstelling tot zoogdieren die volwassenen neurogenese beperkt, zebravis constitutief produceren van nieuwe neuronen langs de gehele hersenen as gedurende hun leven. De zebravis volwassen hersenen toont meerdere neurogene nissen harboring neurale stam / progenitorcellen die zebravis een krachtige modelorganisme voor het begrijpen tHij stamcellen activiteit in de hersenen en de moleculaire programma vereist centrale zenuwstelsel regeneratie. In de afgelopen 17 jaar, verschillende onderzoeksgroepen ontwikkelde methoden voor het isoleren en kweken van de zebravis neurale cellen 8,9. Deze studies waren gericht op het produceren embryonale neuronale en gliale cellen in vitro, maar niet op het handhaven NSC en het onderzoeken van hun eigenschappen. Hoewel neurospheres hebben in de volwassen apteronotus leptorhynchus (Brown Ghost knifefish) 10 is gegenereerd, een neurosphere vormende test in de zebravis nog worden vastgesteld.
Hier beschrijven we een neurosfeer vormende bepaling om de rol van miR-107 tonen tijdens zebravis neurogenese 11. Het protocol stelt: 1) het verzamelen van de volwassen neurale stamcellen / voorlopercellen, hetzij van de zebravis hele hersenen of uit verschillende ontleed hersengebieden zoals de telencephalon, de Tectum, en het cerebellum; 2) het genereren van fldrijvende en zelf-vernieuwing van neurospheres van volwassen neurale stamcellen / voorlopercellen; 3) de down- en up-regulatie van de expressie van coderende genen of kleine niet-coderende RNAs 11 in neurosferen, zodat hun rol bij de proliferatie en differentiatie van neurale stamcellen / voorlopercellen te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hoofddoel van dit protocol het isoleren en kweken volwassen zebravissen hersenen afgeleide neurosferen voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire kenmerken van neurale stam / voorlopercellen. Hier melden wij hoe multipotente neurale cellen te selecteren en het genereren van de drie neurale celtypes, dat wil zeggen, astrocyten, neuronen en oligodendrocyten, van de volwassen hersenen zebravis. Het protocol is zeer belangrijk omdat een reproduceerbare neurosfeer vormende assay was niet in de zebravis va…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).
Materials
| DPBS 1X | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1X | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
Riferimenti
- Rietze, R.L., & Reynolds, B.A. Neural stem cell isolation and characterization. Methods Enzymol. 419, 3-23, (2006).
- Brewer, G.J., & Torricelli, J.R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2, 1490-1498, (2007).
- Guo, W., Patzlaff, N.E., Jobe, E.M., & Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7, 2005-2012, (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., & Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8, 486-498, (2011).
- Winter, M. et al. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing. Nat Protoc. 6, 1942-1952. (2011).
- Gage, F.H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438, (2000).
- Reynolds, B.A., & Rietze, R.L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336, (2005).
- Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., & Collodi, P. Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes. Cytotechnology. 23, 221-230, (1997).
- Chen, Z. et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio). PloS one. 8, e57539, (2013).
- Hinsch, K., & Zupanc, G.K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696, (2007).
- Ristori, E. et al. A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis. Dev Cell., 32, 546-560, (2015).
- Louis, S. K. and SIegel A. C. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods. Methods Mol Bio., 740, (2011).
- Harrison, M.M., Jenkins, B.V., O'Connor-Giles, K.M., & Wildonger, J. A CRISPR view of development. Genes dev. 28, 1859-1872, (2014).
- Marz, M. et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888, (2010).
