Isolierung und Kultur von Adult Zebrafisch brain-derived Neurosphären
Summary
Hier stellen wir ein reproduzierbares Verfahren adulte Neurogenese zu untersuchen, aus dem gesamten Gehirn stamm eine Neurosphäre Assay verwendet oder von entweder dem telencephalic, tectal oder cerebellar Regionen des adulten Gehirns Zebrabärbling. Zusätzlich beschreiben wir das Verfahren der Genexpression in Zebrabärbling Neurosphären zu manipulieren.
Abstract
The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.
Introduction
Mammalian neurale Stammzellen (NSC) wurden in freischwimmenden Kulturen als Cluster von sich teilende Zellen genannt Neurospheres 1 in vitro durch ihre Fähigkeit , zu wachsen charakterisiert. In Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), NSC dividieren entweder symmetrisch selbst erneuernden NSC zu erzeugen, oder asymmetrisch zwei verschiedenen Tochterzellen zu erzeugen, dh., Eine differenzierende Vorläuferzelle und eine neuartige NSC. Neurosphere Kulturen sind daher eine Mischung aus neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen und differenzierten neuralen Zellen 2-4 NSC kann jedoch aus anderen Neurosphäre Zelltypen von zwei spezifischen Eigenschaften unterscheiden:. Sie in Freilangfristigen Selbsterneuerungs anzuzeigen Floating – Kulturen und sie können in allen neuralen Zelllinien (dh Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten) nach Entzug der Wachstumsfaktoren und Adhäsion an extrazelluläre Matrixsubstraten unterscheiden. in mammals die Neurosphärenkultur – System war das erste di – vitro – System verwendet , um die Anwesenheit von NSC im erwachsenen Gehirn zu zeigen , und ist die am häufigsten verwendeten Werkzeug Proliferation, Selbsterneuerungskapazität und Multipotenz von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen zu analysieren. Deshalb, auch wenn Kugel bildenden Tests von einigen Nachteilen und Einschränkungen 4 ist dieses Kultursystem ist wertvoll für das Potential einer Zelle Auswertung als Stammzelle zu verhalten , wenn sie 4 aus seiner in vivo Nische entfernt und hat bei der Identifizierung von Schlüsselregulatoren instrumental von NSC Selbsterneuerung und Zellschicksal Bestimmung 5-7.
Im Gegensatz zu den Säugetieren, die adulte Neurogenese beschränkt haben, Zebrabärbling produzieren konstitutiv neue Neuronen entlang der gesamten Gehirns Achse während ihrer gesamten Lebensdauer. Der Zebrabärbling erwachsenen Gehirn zeigt mehrere neurogenen Nischen neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen beherbergen ein leistungsfähiges Modellorganismus machen Zebrabärbling t für das Verständniser Stammzellaktivität im Gehirn sowie die molekularen Programme für das zentrale Nervensystem die Regeneration erforderlich. In den letzten 17 Jahren entwickelte sich mehrere Arbeitsgruppen Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Zebrabärbling neuralen Zellen 8,9. Diese Studien wurden bei der Herstellung embryonalen neuronalen und Glia – Zellen , in vitro gerichtet, aber nicht auf NSC Aufrechterhaltung und Untersuchung ihrer Eigenschaften. Obwohl Neurosphären haben im erwachsenen Apteronotus leptorhynchus (Brown – Geist Messerfisch) 10, ein Neurosphären-Bildungstest in der Zebrabärbling blieb etabliert werden generiert.
Hier beschreiben wir eine Neurosphere-Bildungstest die Rolle der miR-107 während der Zebrabärbling Neurogenese 11 zu demonstrieren. Das Protokoll ermöglicht: 1) die Sammlung von adulten neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen entweder von Zebrabärbling gesamte Gehirn oder aus mehreren seziert Hirnregionen wie das Telencephalon, Tectum und Cerebellum; 2) die Erzeugung von flFlie und selbst erneuernden Neurosphären von adulten neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen; 3) die Down- und Hochregulation der Expression von kodierenden Genen oder kleine nicht-kodierenden RNAs 11 in Neurosphären, um ihre Rollen bei der Proliferation und Differenzierung von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Hauptziel dieses Protokoll ist zur Isolierung und Kultur adult Zebrabärbling Gehirn stammNeuroSphären für die zellulären und molekularen Eigenschaften von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen zu studieren. Hier berichten wir , wie multipotenten neuralen Zellen auszuwählen und erzeugen die drei neuronalen Zelltypen, das heißt, Astrozyten, Neuronen und Oligodendrozyten, vom erwachsenen Zebrafischgehirn. Das Protokoll ist sehr bedeutsam, da eine reproduzierbare Neurosphäre bildenden Assays bislang ni…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).
Materials
| DPBS 1X | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1X | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
Riferimenti
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