Isolement et culture de neurosphères Adult Zebrafish Brain-dérivés
Summary
Ici, nous fournissons une méthode reproductible pour examiner la neurogenèse adulte en utilisant un essai de neurosphères dérivées de l'ensemble du cerveau ou de l'une ou l'autre télencéphalique, tectale ou des régions cérébelleuses du cerveau adulte de poisson zèbre. En outre, nous décrivons la procédure de manipuler l'expression des gènes dans les neurosphères de poisson zèbre.
Abstract
The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.
Introduction
Les cellules souches neurales de mammifère (NNC) ont été caractérisées in vitro par leur aptitude à croître dans des cultures flottantes comme des amas de cellules en division appelées neurosphères 1. En présence du facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance des fibroblastes (FGF), le NNC se divisent de manière symétrique pour générer NNC d'auto-renouvellement, ou asymétriquement pour produire deux cellules filles différentes, à savoir., Une cellule progénitrice de différenciation et un nouveau CNS. Cultures neurosphères sont donc un mélange de cellules souches / progénitrices neurales et des cellules neurales plus différenciées 2-4 NSCs peuvent cependant être distinguées des neurosphères autres types de cellules par deux propriétés spécifiques:. Ils affichent à long terme d' auto-renouvellement Free- les cultures flottantes et elles peuvent se différencier en toutes les lignées cellulaires de neurones ( par exemple, les neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes) après le retrait des facteurs de croissance et de l' adhérence à des substrats de la matrice extracellulaire. Dans mammals, le système de culture de neurosphères a été le premier système in vitro utilisé pour démontrer la présence de NNC dans le cerveau adulte et reste l'outil le plus couramment utilisé pour analyser la prolifération, la capacité d' auto-renouvellement et multipotence des cellules souches et progénitrices neurales. Par conséquent, même si les essais de sphère formant souffrent de certains inconvénients et limitations 4, ce système de culture est utile pour évaluer le potentiel d'une cellule à se comporter comme une cellule souche lorsqu'elle est retirée de sa niche in vivo 4 et a joué un rôle dans l' identification des régulateurs clés de NSC auto-renouvellement et le destin des cellules détermination 5-7.
Contrairement aux mammifères qui ont limité la neurogenèse adulte, le poisson zèbre produisent constitutivement nouveaux neurones le long de l'axe du cerveau entier tout au long de leur vie. Le cerveau du poisson zèbre adulte affiche plusieurs niches neurogène hébergeant souches neurales / cellules progénitrices rendant zebrafish un organisme modèle puissant pour comprendre til endiguer l'activité des cellules dans le cerveau, ainsi que les programmes moléculaires nécessaires à la centrale régénération du système nerveux. Au cours des 17 dernières années, plusieurs groupes de recherche ont développé des méthodologies pour l' isolement et la culture de cellules neuronales 8,9 poisson zèbre. Ces études visaient à produire des neurones embryonnaires et les cellules gliales in vitro, mais pas au maintien de NNC et enquêter sur leurs propriétés. Bien que neurosphères ont été générés chez l'adulte Apteronotus leptorhynchus (Brown fantôme knifefish) 10, un dosage de neurosphères formant chez le poisson zèbre reste à établir.
Nous décrivons ici un essai de Neurosphère formation à démontrer le rôle de miR-107 au cours de la neurogenèse zebrafish 11. Le protocole permet: 1) la collecte des adultes cellules souches / progénitrices neurales soit de zebrafish ensemble du cerveau ou de plusieurs régions du cerveau disséqués comme le télencéphale, tectum, et le cervelet; 2) la production de flottant et neurosphères d'auto-renouvellement de cellules souches / progénitrices neurales adultes; 3) l'aval et la régulation de l'expression des gènes codant ou petits ARN non codantes 11 en neurosphères, afin d'enquêter sur leur rôle dans la prolifération et la différenciation des cellules souches / progénitrices neurales.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'objectif principal de ce protocole est d'isoler et de la culture adulte poisson zèbre neurosphères cérébrales dérivées pour étudier les caractéristiques cellulaires et moléculaires de cellules souches / progénitrices neurales. Ici, nous rapportons comment sélectionner les cellules neurales pluripotentes et de générer les trois types de cellules neurales, à savoir, les astrocytes, neurones et les oligodendrocytes, du cerveau adulte zebrafish. Le protocole est très significatif car un ess…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).
Materials
| DPBS 1X | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1X | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
Riferimenti
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