성인 Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리 및 문화
Summary
여기에서 우리는 전체 뇌 또는 telencephalic, tectal 또는 성인 zebrafish의 뇌의 소뇌 영역 중 하나에서 파생 neurosphere 분석을 사용하여 성인 신경을 검사 할 수있는 재생 가능한 방법을 제공한다. 또한, 우리는 제브라 피쉬 neurosphere를 유전자 발현을 조작하는 절차를 설명한다.
Abstract
The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.
Introduction
포유류 신경줄 기세포 (NSCs의)는 neurosphere를 1이라 세포의 클러스터로 분할 부동성 배양에서 성장하는 능력에 의해 시험 관내에서 특성화되었다. 표피 성장 인자 (EGF) 및 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)의 존재하에 NSCs의 자기 갱신 NSCs을 생성하기 위해 하나 대칭 분할 또는 비대칭 적으로 서로 다른 두 딸 세포를 생성하는 예., 미분 전구 세포 및 신규 NSC. Neurosphere 문화 따라서 신경 줄기 / 전구 세포보다 분화 된 신경 세포 2-4의 혼합물이다 NSCs을하지만,이 특정 속성에 의해 다른 neurosphere 세포 유형을 구별 할 수 있습니다. 그들은 자유에 장기 자기 갱신을 표시 문화 부동 그들은 세포 외 매트릭스 기판에 성장 인자의 철수 및 부착 다음 모든 신경 세포 계통 (즉, 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포)로 분화 할 수 있습니다. mamm에서ALS, neurosphere 배양 시스템은 성인 뇌 NSCs의 존재를 입증하는 데 사용되는 제 관내 시스템이고 증식자가 재생 능력과 신경 줄기 세포 및 선조 세포의 다 능성을 분석하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 도구가 남아있다. 따라서, 구 형성 분석법 단점과 한계 4 고통에도이 배양 시스템은 생체 내 틈새 (4)로부터 제거되어 키 레귤레이터 식별 쓸모 때 줄기 세포처럼 행동하는 세포의 잠재력을 평가하는데 유용 NSC 자기 갱신과 세포 운명 결정 5-7의.
성인 신경 제한된 포유류 달리 지브라 피쉬는 구조적 그들의 수명 동안 뇌 전체 축을 따라 새로운 뉴런을 생성한다. 제브라 피쉬 성인의 뇌는 t을 이해하기위한 제브라 피쉬에게 강력한 모델 생물을 신경 줄기 / 전구 세포를 품고 여러 신경 인성 틈새를 표시그 세포는 뇌 활동뿐만 아니라 중추 신경계 재생을위한 필요한 분자 프로그램 줄기. 지난 십칠년 동안 여러 연구 그룹은 분리하고 제브라 피쉬의 신경 세포 8,9 배양을위한 방법론을 개발했다. 이 연구는 배아 신경 세포 및 생체 외에서 아교 세포를 생산을 목표로,하지만 NSCs을 유지하고 그들의 특성을 조사하고 있었다. neurosphere를가 성인 Apteronotus의 leptorhynchus (브라운 유령 Knifefish) (10)에서 생성되었지만, 제브라 피쉬의 neurosphere 형성 분석은 설정 될 남아 있었다.
여기에서 우리는 제브라 피쉬의 신경 (11) 동안은 miR-107의 역할을 설명하기 neurosphere 형성 분석을 설명합니다. 프로토콜은 수 1) 지브라 피쉬 뇌 전체에서 또는 telencephalon, tectum 및 소뇌 여러 해부 뇌 영역에서 어느 성인 신경 줄기 / 선조 세포의 수집; FL 2) 생성oating 성인 신경 줄기 / 전구 세포의 자기 갱신 neurosphere를; 3) 하향과 상향 조정 코딩하는 유전자 또는 작은 비 코딩 RNA를 neurosphere를 11의 표현의 순서는 신경 줄기 / 전구 세포의 증식 및 분화에서의 역할을 조사합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 주요 목표는 신경 줄기 / 전구 세포의 세포 및 분자 기능 연구를위한 분리 및 배양 성인 zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를하는 것입니다. 여기, 우리는 성인 zebrafish의 뇌에서, 다 능성 신경 세포를 선택하고 세 개의 신경 세포 유형, 즉, 성상 세포, 신경 세포 및 희소 돌기 아교 세포를 생성하는 방법을보고합니다. 재현성 neurosphere 형성 분석은 지금까지 제브라 피쉬 년에 설립?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).
Materials
| DPBS 1X | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1X | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
Riferimenti
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