Yetişkin balığı beyin türevli Neurospheres İzolasyon ve Kültürü
Summary
Burada tüm beyin veya telencephalic, tectal veya yetişkin zebrabalıkları beyin beyincik bölgelerinin türetilen bir neurosphere tahlili kullanılarak yetişkin nöron incelemek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Ayrıca, zebrabalıkları neurospheres gen ifadesini işlemek için prosedürü açıklar.
Abstract
The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.
Introduction
Memeli nöral kök hücreler (NSC'lerde) Neurospheres 1 olarak adlandırılan hücrelerin bölünmesi kümeleri gibi serbest bir kültürlerinde gelişme yetenekleri ile, in vitro olarak karakterize edilmiştir. Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) varlığında, NSC'lerde kendini yenileyen NSCs oluşturmak için ya da simetrik olarak bölmek veya asimetrik, iki farklı yavru hücrelere oluşturmak için, yani. Bir ayırıcı projenitör hücre ve yeni bir MGK. Neurosphere kültürler, bu nedenle nöral kök / progenitör hücrelerin ve daha fazla farklı sinir hücrelerinden 2-4 bir karışımı olan NSC'lerde Ancak iki spesifik özellikleri ile, diğer neurosphere hücre tiplerinden ayırt edilebilir. Bunlar serbest uzun süreli kendini yenileme görüntüler kültürleri yüzen ve hücre dışı matriks substratlara büyüme faktörlerinin geri çekilmesi ve yapışma takiben tüm nöral hücre soyları (yani, nöronlar, astrositler ve oligodendrosit) içine ayırt edebilirsiniz. memeli konakçının içindeALS, neurosphere kültür sistemi, yetişkin beyinde NSC'lerde varlığını göstermek için kullanılan ilk tüp sistemi ve proliferasyonu, kendi kendini yenileme ve nöral kök ve projenitör hücrelerinin multipotency analiz etmek için en sık kullanılan araç. Bu nedenle, küre oluşturan deneyleri bazı dezavantajları ve sınırlamalar 4 muzdarip olsa da, bu kültür sistemi kendi in vivo niş 4 çıkarılır ve kilit düzenleyiciler belirlenmesinde etkili olmuştur zaman kök hücresi gibi davranmaya bir hücrenin potansiyelini değerlendirmek için değerlidir MGK kendini yenileme ve hücre kader tayini 5-7.
yetişkin nörogenezi sınırlı memelilere aksine, Zebra balığı yapısal hayatları boyunca tüm beyin ekseni boyunca yeni nöronlar üretirler. Zebra balığı yetişkin beyin t anlamak için Zebra balığı güçlü bir model organizma yapma nöral kök / progenitör hücreler barındıran birden nörojenik nişler görüntülerHücrenin beyinde aktivitesi hem de merkezi sinir sistemi rejenerasyonu için gerekli olan moleküler programları kaynaklanıyor. Geçtiğimiz 17 yıl içinde, çeşitli araştırma grupları izole ve Zebra balığı sinir hücreleri 8,9 kültürleme için yöntemler geliştirmiştir. Bu çalışmalar embriyonik nöronal ve in vitro glial hücreler üretmeyi amaçladığını, ancak NSCs korumak ve onların özelliklerini incelemeyi bulundu. Neurospheres yetişkin Apteronotus leptorhynchus (Brown hayalet Knifefish) 10 içinde olmasına rağmen, zebrabalıkları bir neurosphere oluşturucu deney kurulacak kalmıştır.
Burada zebrabalıkları nöron 11 sırasında miR-107 rolünü göstermek için bir neurosphere oluşturan deneyi açıklar. protokol sağlar: 1) Zebra balığı bütün beyin ya da telencephalon, tektum ve beyincik gibi çeşitli disseke beyin bölgelerinden ya yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerin toplanması; fl 2) nesiloating ve yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerden kendini sürekli yenileyen Neurospheres; 3) aşağı ve yukarı yönde regülasyonu kodlayan genlerin ya da küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar neurospheres 11, ekspresyon için nöral kök / progenitör hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması rollerini araştırmak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün amacı nöral kök / progenitör hücrelerin hücresel ve moleküler özellikleri incelemek için izole etmek ve kültür yetişkin zebrafish beyin kaynaklı Neurospheres etmektir. Burada, yetişkin zebrafish beyin, multipotent nöral hücreleri seçmek ve üç sinir hücre tipleri, yani astrositler, nöronlar ve oligodendrositleri oluşturmak için nasıl rapor. tekrarlanabilir neurosphere oluşturan deneyi şimdiye kadar zebrabalıkları kurulmuş olmasaydı bu yana protokol son derece önemlid…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).
Materials
| DPBS 1X | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1X | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
Riferimenti
- Rietze, R.L., & Reynolds, B.A. Neural stem cell isolation and characterization. Methods Enzymol. 419, 3-23, (2006).
- Brewer, G.J., & Torricelli, J.R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2, 1490-1498, (2007).
- Guo, W., Patzlaff, N.E., Jobe, E.M., & Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7, 2005-2012, (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., & Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8, 486-498, (2011).
- Winter, M. et al. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing. Nat Protoc. 6, 1942-1952. (2011).
- Gage, F.H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438, (2000).
- Reynolds, B.A., & Rietze, R.L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336, (2005).
- Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., & Collodi, P. Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes. Cytotechnology. 23, 221-230, (1997).
- Chen, Z. et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio). PloS one. 8, e57539, (2013).
- Hinsch, K., & Zupanc, G.K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696, (2007).
- Ristori, E. et al. A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis. Dev Cell., 32, 546-560, (2015).
- Louis, S. K. and SIegel A. C. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods. Methods Mol Bio., 740, (2011).
- Harrison, M.M., Jenkins, B.V., O'Connor-Giles, K.M., & Wildonger, J. A CRISPR view of development. Genes dev. 28, 1859-1872, (2014).
- Marz, M. et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888, (2010).
