Summary
توضح هذه المقالة كيفية حقن ناقلات فيروسية في القشرة الأمامية الماوس لاختبار المقايسات السلوكية التي تتطلب هذه العملية من تشكيل مغايرة التغصن.
Introduction
المهلوسات، مثل LSD، سيلوسيبين ومسكالين تسبب تغيرات كبيرة في الوعي البشري، والإدراك والعاطفة 7-9. تثبيط السيروتونين 5-HT 2A مستقبلات الإشارات التي كتبها النهج إما وراثية أو الدوائية يسبب مخففة بشكل ملحوظ الاستجابات السلوكية لالمهلوسات في كلا النموذجين القوارض والبشر 3،10 11. على الرغم من المهلوسات ربط فرعية مستقبلات أخرى 8، تعتبر مستقبلات 2A 5-HT حسب الضرورة لنشاط سلوكي فريد من هذه المواد الكيميائية.
وكانت المجموعة الثانية مستقبلات الجلوتامات (أي، mGlu2 وmGlu3) هدف اهتماما كبيرا بشأن الآلية الجزيئية من المهلوسات ودورها لا يتجزأ من وراء الذهان 12. سابقا، وقد تبين أن الفئران من دون التعبير عن بروتين mGlu2 (mGlu2-KO الفئران) لا تعير اهتماما للآثار الخلوية والسلوكية للنصفlucinogens 5. وقيل أيضا أن 2A 5-HT والمستقبلات mGlu2 تشكيل مجمع مغايرة التغصن محدد من خلالها السيروتونين والغلوتامات بروابط تعدل نمط G اقتران البروتين في الخلايا الحية 1،2.
هيكليا، عبر الغشاء (TM) مجالات 4 و 5 من mGlu2 تلعب دورا أساسيا في تشكيل مغايرة التغصن مع 5-HT 2A مستقبلات 5. بالإضافة إلى ذلك، أظهر مزيد من التحقيقات أن ثلاثة بقايا تقع في نهاية الخلايا من TM4 من mGlu2 ضرورية لتشكيل 5-HT 2A -mGlu2 مستقبلات heterocomplex في الخلايا 6 الحية.
وبناء على هذه النتائج لوحظ في أنظمة تعبير مغايرة، ونحن هنا وصف استخدام التعبير بوساطة HSV-من النوع البري mGlu2 وmGlu2 / mGlu3 يبني خيالية في القشرة الأمامية من الفئران mGlu2-KO لاختبار ما إذا كان تشكيل مغايرة التغصن بين 5-HT 2A وmGlu2 هو ضروري لسلوك رئيس نشل الناجمة عن الهلوسة 5-HT منبهات 2A مستقبلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات اللازمة لتربية الحيوانات وهموم وفقا للائحة لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) من مدرسة طب ماونت سيناي. تأكد من استخدام قفازات معقمة في جميع أنحاء الداخلي.
1. المخدرات وفيروس التحضير
- تحضير المخدرات
- إعداد 15.0 مل الكيتامين / زيلازين مخدر عن طريق إذابة 1.35 مل من 100 ملغ / مل الكيتامين و 0.75 مل من 20 ملغ / مل زيلازين في 12.9 مل من 0.9٪ محلول ملحي. مزيج دقيق الحل.
- تحضير فيروس
- استنساخ mGlu2 وmGlu2ΔTM4N يبني في ناقلات bicistronic فيروس الهربس البسيط (HSV) التالية البروتوكولات القياسية الموصوفة سابقا 6. حزمة الجسيمات الفيروسية كما هو موضح سابقا 6،13،14. استبدال بقايا علاء-677 4.40، علاء-681 4.44 و 4.48 Ala685 في mGlu2 لSer686 4.40، دكتوراهE690 4.44 والغليسين-694 4.48 في mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) قد تم وصفها سابقا 6.
ملاحظة: وقد تجلى سابقا أن بناء خيالية HA-mGlu2ΔTM4N وأعرب في غشاء البلازما مع G سليمة تعتمد البروتين مما يشير إلى 6. - تخزين ناقلات فيروسية في -80 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال. ناقلات فيروسية ذوبان على الجليد، ومن ثم قسامة في 10 مكل. لإجراء العمليات الجراحية، والحفاظ على الجليد.
- استنساخ mGlu2 وmGlu2ΔTM4N يبني في ناقلات bicistronic فيروس الهربس البسيط (HSV) التالية البروتوكولات القياسية الموصوفة سابقا 6. حزمة الجسيمات الفيروسية كما هو موضح سابقا 6،13،14. استبدال بقايا علاء-677 4.40، علاء-681 4.44 و 4.48 Ala685 في mGlu2 لSer686 4.40، دكتوراهE690 4.44 والغليسين-694 4.48 في mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) قد تم وصفها سابقا 6.
2. جراحة
- التحضير لعملية جراحية
- وزن الماوس وحقن الفأر مع الجرعة المناسبة من كوكتيل الكيتامين / زيلازين (لمزيد من التفاصيل، انظر 1.1.1).
- تحقق الماوس لمعرفة ما إذا كان تخدير بشكل صحيح، ضغط القدم وذيل للاستجابة الألم، وإذا كان غير قادر للحصول على رد، هو تخدير الماوس بشكل صحيح.
- حلق الرأس الماوس من قاعدة الجمجمة إلى طرف الأنف باستخدام كليبرز. تطبيق هلام للعين للبالعربية الماوسterward للوقاية من العمى من الفأرة.
- تحميل كل حقنة على الإطار التجسيمي. ثم إمالة الجزء العمودي من كل ذراع من الإطار التجسيمي بحيث تكون 10 درجة بعيدا عن وضعها الطبيعي. ضمان إمالة الأسلحة، مثل أن الإبر في مواجهة بعضهما البعض.
- تنظيف كل حقنة عن طريق ملء الإبرة مع 70٪ من الإيثانول. شغل الإبرة ثلاث مرات على الأقل للتأكد من أن حقنة نظيفة.
- مرة واحدة وقد تم تنظيف الإبرة، وتدفق إبرة عن طريق ملء الإبرة مع مزدوج H المقطر 2 O. مرة واحدة طهرتها، وملء كل إبرة مع 1.3 ميكرولتر من ضعف H المقطر 2 O. تحريف المكبس من حقنة لاطلاق سراح 0.3 ميكرولتر من ضعف H المقطر 2 O. إذا حبات الماء في رأس الإبرة، يمسح بعناية بعيدا المياه. إذا كان أي شيء يخرج من الحقنة، ودفع المكبس تماما أسفل ثم كرر تنظيف حقنة.
- بعد ملء مع الماء، ثم سحب ما يصل إلى حقنة ملء الحقنة مع0.5 ميكرولتر من الهواء.
- مرة واحدة في الهواء والماء في الحقنة، وملء بعناية المحاقن مع 1.3 ميكرولتر من حل الفيروس. في هذه المرحلة التأكد من حجم التداول الكلي في حقنة 2.8 ميكرولتر. مرة أخرى تحريف غيض من حقنة لاطلاق سراح 0.3 ميكرولتر من الفيروس. إذا حبات السائل في رأس الإبرة، يمسح بعناية بعيدا السائل. إذا كان أي شيء يخرج من الحقنة، ودفع المكبس تماما أسفل ثم كرر تنظيف حقنة.
- العملية الجراحية
- إرفاق الماوس إلى الإطار التجسيمي، مع التأكد من ضبط الإطار التجسيمي بحيث الجمجمة هو مستوى ومسطحة. تقديم طلب povodine اليود على فروة الرأس المكشوفة. باستخدام مشرط، وجعل شق السهمي على طول خط الوسط من الجمجمة داخل منطقة حلق عرضة للخطر. ثم إرفاق المشابك سحاحة على الجلد في موقع شق للتأكد من أن الجمجمة لا تزال عرضة للخطر.
- استخدام H 2 O 2 إلى حل بعيدا السمحاق لفضح خيوط منالجمجمة. الآن وبعد أن bregma وخيوط مرئية، تأكد من ضبط الإطار التجسيمي للتأكد من أن الجمجمة هي المستوى.
- محاذاة نصائح إبرة الحقن مع bregma وتسجيل إحداثيات bregma. حساب إحداثيات حيث تسير الإبر التي ستدرج لاحقا.
- للطائرة منقاري-Cauldal (RC)، إضافة 1.6 ملم إلى إحداثيات bregma RC سجلت (+1.6 من Bregma). للطائرة ظهري، بطني (DV)، طرح 2.4 ملم من الإحداثيات bregma DV سجلت (-2.4 من Bregma).
- وأخيرا، لطائرة الإنسي الوحشي (ML)، إضافة 2.6 ملم إلى إحداثيات bregma ML سجلت (+2.6 من Bregma). لجميع الإحداثيات تأكد من تسجيل كل من الإحداثيات الأيمن والأيسر، وهذا هو حقن الثنائي.
- جلب الإبر إلى الإحداثيات المطلوبة. بمناسبة أماكن حيث الإبر تسير لإدراجها مع وجود حفر، حفر المناطق ملحوظ.
- مع القطن طرف قضيب وايالمؤسسة العامة بعيدا من أي فائض الدم أو العظام شظية.
- جلب الإبر في الجمجمة حيث نصائح من الإبر ولمس سطح الدماغ. ثم خفض الإبر إلى إحداثيات المطلوب خفضها ببطء.
- وبمجرد أن الإبر في الإحداثيات المطلوبة، وضخ ببطء محتويات الحقنة قبل التواء المكبس من إبرة 0.1 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة على مدى 5 دقائق (في مجموع 0.5 ميكرولتر).
- مرة واحدة وقد تم إجراء حقن مغادرة حقنة في القشرة لمدة 5 دقائق أخرى.
- إغلاق أعلى / رعاية
- إزالة الإبر من القشرة الماوس بشكل مطرد وببطء. ثم إزالة الماوس من الإطار التجسيمي.
- تطبيق cyanoacrylate (لاصق الجلدي) إلى اللوحات قاعدة من الجلد من شق ثم مع ملقط انتزاع اللوحات من الجلد ووضعها معا.
- السماح للcyanoacrylate حتى يجف. ضع الماوس في قفص على وسادة التدفئة (سادة التدفئة اختيارية إذا كان عياداتيتم الاحتفاظ جناح كال تحت RT من 37 درجة مئوية - على خلاف ذلك لم يكن ضروريا). تأكد من وضع الماوس على منشفة ورقية للتأكد من أن الفراش لا تلتزم موقع الجراحة.
- اعتمادا على المدة التي تستغرقها الإجراءات الجراحية، تأكد من أن الفئران هي من التخدير خلال 30 - 60 دقيقة بعد الإجراء. بعد الجراحة، يتم وضع الحيوانات في قفص خاص بها ومراقبتها حتى يصبح واعيا قبل أن يعود إلى غرفته لاسترداد. لا تستخدم المسكنات بعد العملية، لأنها قد تغير نتائج تجاربنا عن طريق تعديل بعض المسارات البيوكيميائية دماغ. ومع ذلك، يتم مراقبة الحيوانات حتى يشفى من التخدير في يوم من الجراحة، واليومية بعد العملية لعلامات العدوى وتقييم الألم / الشدة.
تجربة 3. رئيس نشل الاستجابة
- اقامة
- تنفيذ جميع التجارب السلوكية 10:00 حتي 02:00، 2 - بعد 3 أيام stereotaحقن CTIC من الجسيمات الفيروسية.
- حل (±) -1- (2،5-dimethoxy-4-iodophenyl) هيدروكلوريد -2-aminopropane (دوى) في محلول ملحي 0.9٪ إلى 2.0 ملغ / كغ. أيضا إعداد محلول ملحي 0.9٪.
- إعداد قفص المنزل (28 × 18 × 15 سم) ودون أي فراش وباستخدام جراب الثلاثية، وضبط الكاميرا بحيث ترى كاميرا الفيديو مباشرة فوق القفص المنزل.
- روض الفئران إلى غرفة لمدة 4 على الأقل ساعة قبل بداية التجربة.
- تشكيل لكاميرا الفيديو لتسجيل نشل الرأس.
- تجربة
- وضع الكاميرا بحيث تكون مباشرة على قفص المنزل. معايرة الكاميرا بحيث قفص المنزل بأكمله في مجال الرؤية.
- وزن الماوس وحقن الفأر البريتونى مع الجرعة المناسبة من أي 0.9٪ المالحة أو دوى (0.01 مل / ز). ملاحظة: إذا كان الماوس يزن 25 غراما، وإدارة الجرعة إلى إجمالي حجم 0.25 مل.
- وضع كل الماوس مرة أخرى في قفص وطنهم FOص 10 دقيقة. بعد 10 دقيقة، ومكان الماوس في وسط قفص المنزل فارغ والتحقق من أن عدم وجود البقع العمياء في مجال الرؤية للكاميرا. سجل اضغط على كاميرا الفيديو. غادر الغرفة.
ملاحظة: حركات الماوس ومختلف الاستجابات السلوكية فيه (... رئيس نشل، الصفر الأذن، وما إلى ذلك يرجى الرجوع إلى الجدول البيانات التكميلية 1 من غونزاليس مايسو وآخرون عام 2007 لقائمة كاملة من الاستجابات السلوكية الناجمة عن دوى) 3، وسوف يتم تسجيلها ل 30 دقيقة. ولذلك، من المهم عدم وجود البقع العمياء في مجال الرؤية المسجلة. - بعد إيقاف 30 دقيقة تسجيل على الكاميرا ومكان الماوس مرة أخرى في قفص الموطن الأصلي. كرر هذه العملية لكل الماوس.
- مراجعة
- لدينا كل مراجعة الحكم الأشرطة الطرف عن الظروف التجريبية من الماوس (أي.، الأدوية المستخدمة خلال رئيس نشل التجربة أو فيروس المستخدمة أثناء الحقن داخل الجمجمة)). تسجيل يدويا كل رئيس نشل ماراالحوت الفيديو.
ملاحظة: يتم تحديد رئيس نشل كحركة رئيس الهز السريعة التي أجراها الماوس (فيديو التكميلي). - لكل الماوس، ومتوسط الاستجابة HTR النهائية من المجاميع ثلاثة من الحكام أعمى. ثم تجميع هذه القيم عن طريق حالة تجريبية وإجراء تحليل إحصائي (أي، اختبار t أو ANOVA).
- لدينا كل مراجعة الحكم الأشرطة الطرف عن الظروف التجريبية من الماوس (أي.، الأدوية المستخدمة خلال رئيس نشل التجربة أو فيروس المستخدمة أثناء الحقن داخل الجمجمة)). تسجيل يدويا كل رئيس نشل ماراالحوت الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتبين النتائج السابقة أن رئيس نشل استجابة سلوكية الفئران وموثوق بها وبقوة التي تسببها حبوب الهلوسة، وينعدم في 5-HT الفئران 2A -KO 3. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن استجابة رئيس نشل التي تسببها والهلوسة 5-HT منبهات 2A دوي وLSD وانخفضت بشكل ملحوظ في mGlu2-KO الفئران 5. ومع ذلك، على الرغم من النتائج السابقة تبرهن بشكل مقنع أن 2A 5-HT وmGlu2 يتم تجميعها كما مجمع مغايرة التغصن في المختبر في خلايا transfected 1،2،15، ما إذا كان هذا الترتيب الهيكلي يتصرف على هذا النحو في الفئران التي تعيش بقيت دون حل. إلى فهم كامل للدور 5-HT 2A -mGlu2 heterocomplex مستقبلات في الآثار النفسية مثل الناجم عن الهلوسة 5-HT منبهات 2A مستقبلات والتعبير إما mGlu2 أو mGlu2ΔTM4N في القشرة الأمامية من الفئران mGlu2-KO إلى دراسة ما إذا كانت هذه manip ulation ينظم السلوك.
تلقى الفئران حقن القشرية داخل أمامي من bicistronic HSV التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) وإما mGlu2 أو mGlu2ΔTM4N، أو GFP وحدها. أولا، تم التأكيد على أن الفيروس عبر-يعبر عن mGlu2 أو mGlu2ΔTM4N في القشرة الماوس أمامي (الشكلان 1A و 1B). كما هو موضح سابقا 5، كان سلوك رئيس نشل الناجمة عن دوى غائبة في الفئران mGlu2-KO حقن مع ناقلات فارغة HSV-GFP. والجدير بالذكر، انه تم انقاذ استجابة رئيس نشل الناجمة عن الهلوسة 5-HT 2A ناهض دوى في الفئران mGlu2-KO الإفراط في التعبير عن mGlu2، ولكن ليس mGlu2ΔTM4N، في القشرة الأمامية مقارنة بتلك التي شوهدت في الحيوانات معربا عن GFP (الشكل 1C). معا، وتشير هذه النتائج إلى أن 5-HT 2A -mGlu2 مجمع مستقبلات في القشرة الأمامية أمر بالغ الأهمية لتنظيم الدول مثل الذهان.
ether.within الصفحات = "1"> 
الشكل 1. التعبير عن mGlu2 كما مستقبلات Heterocomplex. والتعبير عن mGlu2 بمثابة مستقبلات مع 2A 5-HT الضروري لسلوك مثل الذهان الناجم عن عقاقير الهلوسة. (أ) صورة الممثل التعبير التحوير بوساطة HSV-في القشرة الأمامية. HSV-mGlu2، والذي يعبر أيضا GFP، تم حقنها في القشرة الأمامية، وكشف النقاب عن التعبير GFP بواسطة مناعية، شريط النطاق، 200 أم. (ب) HSV بوساطة التعبير التحوير في الماوس القشرة الأمامية من الفئران mGlu2-KO، وتم قياس التفاعل مكافحة mGlu2 عن طريق ويسترن التنشيف. وقد سبق أن أكد خصوصية الأجسام المضادة الأولية ضد مستقبلات mGlu2 في الفئران خروج المغلوب 6. مستقبلات الجلوتامات هي GPCRs التي تشكل homodimers مرتبطة تساهميا. قمنا بقياس مناعية من mGlu2 كما مونومر (100 كيلو دالتون) 6. (C وآخرون (2012) (6). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تكميلية الفيديو 1. رئيس نشل الاستجابة. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). تم حقن الفئران CD-1 WT مع 2.0 ملغ / كغ دوى ووضعها في قفص (جدار ظلام دامس بين أقفاص اثنين) للحصول استجابة رئيس نشل (أثارت السلوك بعد *).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جنبا إلى جنب مع النتائج السابقة في mGlu2-KO الفئران 5، النتائج مع mGlu2 وmGlu2 / mGlu3 يبني خيالية التي لا تشكل 5-HT مجمع 2A -mGlu2 مستقبلات في الخلايا المستزرعة تشير إلى أن 2A 5-HT -mGlu2 مغايرة التغصن مجمع مستقبلات في وهناك حاجة الماوس القشرة الأمامية للحث على سلوك رئيس نشل من قبل الهلوسة 5-HT منبهات 2A مستقبلات مثل LSD. وجود قيود على هذا الأسلوب هو أنه لا قياس القرب الجزيئي وثيق على المستوى التحت خلوية في أنسجة الأم. وبالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من النقاط الحرجة أن يكون لاحظت. لأنه يتم حقن الفئران مع ناقلات فيروسية HSV، والإطار الزمني أن التجارب التي يتعين القيام بها هي 2-4 أيام بعد الحقن. وينبغي التحقق من مكان والتعبير عن ناقلات فيروسية مع تلوين المناعي من الدماغ مقطوع بعد ما لا يزيد عن 4 أيام من الحقن الأولي. الفئران التي الإحداثيات لا تتطابق أو لا تعبر عن وناقلات فيروسية يجبسيتم استبعادها من البيانات التجريبية لأنها لا تعبر عن mGlu2 أو mGlu2ΔTM4N. الرعاية بعد الجراحة المجسم حاسمة أيضا، وإغلاق غير لائق من جرح في الرأس يمكن أن يؤدي إلى عدوى التي يمكن أن تسبب مشاكل في كل من التجارب المجراة وتلطيخ المناعي. وأخيرا، وبعد حقن المجسم أي نموذج السلوكي (. حقل مفتوح، بالتناوب اختبار (ت)، وغيرها) يمكن استخدامها طالما أنه ضمن 2-4 بعد حقن جزيئات فيروسية. مرة أخرى، يجب أن تؤكد الإحداثيات والتعبير المناعي.
مفهوم أن GPCRs وظيفة هومو و / أو heteromers في الخلايا الحية هي الآن راسخة 16-18. ومع ذلك، على الرغم من بعض التقدم، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد الدور الدقيق (ق) من مجمعات مغايرة التغصن النوع من الاختزال في النماذج الحيوانية كلها 19. النهج مثل BRET و / أو التصوير الحنق للتحقيق البروتين البروتين القرب المادي داخل أنسجة العميقة من الحيوانات الصغيرةقد توفر نماذج سيلة لتعزيز فهم الدور الوظيفي للheteromers النوع من الاختزال في المواد 20 الذين يعيشون. عن طريق التعبير بوساطة HSV-من GPCRs سواء مواطن أو مع البروتينات عبر الغشاء تعديل، وتقديم نموذج في الجسم الحي لتقييم وظيفة والتفاعل من GPCRs.
وهناك حاجة أيضا إجراء مزيد من الدراسات في نماذج القوارض لدراسة الاستقرار ووقت الحياة-(تشكيل والتفكك) من heteromers لهذه العملية من 21-23، إعادة ترتيب الهيكلية بين مكوناتها 24، والمحتملين G البروتين اقتران بعد مستقبلات استيعاب 25،26. ونظرا للدور الأساسي للGPCRs في الخلايا مما يشير الى وظيفة، يبدو من المرجح أن هذه المنطقة قد يؤدي إلى الدراسات الأساسية ومتعدية مثيرة للاهتمام.
على الرغم من أن هناك حاجة إلى مزيد تحقيق لتحديد خصائص كميا التركيبية شارك في توطين كل من المستقبلات في الجهاز العصبي المركزي الإنسان والفأر، جنبا إلى جنب مع ستو السابقمات التي تثبت مقنع الكهربية الخلوية، والاستجابات السلوكية الناجمة عن المهلوسات في نماذج الفئران وجوهري ل5-HT 2A، معربا عن مستقبلات الخلايا العصبية الهرمية القشرية 3،27،28، والنتائج التي تم الحصول عليها باستخدام نهج التعبير بوساطة HSV-الموصوفة هنا تشير هناك حاجة إلى تشكيل مغايرة التغصن بين 5-HT 2A وmGlu2 المستقبلات في الماوس القشرة الأمامية لسلوك مثل الذهان رأس نشل الناجمة عن الهلوسة 5-HT 2A مستقبلات ناهض دوى.
التعبير عن mGlu2 HSV بوساطة، ولكن ليس mGlu2ΔTM4N، في العصبونات القشرية الأمامية من mGlu2-KO الفئران تنقذ سلوك رئيس نشل الناجمة عن الهلوسة 5-HT 2A مستقبلات ناهض دوى. قد تكون هذه الأداة متعدية المفيد للالدراسات قبل السريرية لتقييم الظواهر السلوكية للheteromers النوع من الاختزال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
شارك المعاهد الوطنية للصحة R01MH084894 في تمويل هذه الدراسة. ونود أن نشكر الدكاترة. ياسمين هيرد وسكوت روسو في كلية جبل سيناء للطب للتبرع من الفئران واستخدام مرافق الجراحة وسلوكهم أثناء تصوير هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mGlu2 bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| mGlu2ΔTM4N bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| GFP bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| Xylazine | Lloyd | List no. 4811-20ml, NADA #139-236, NDC Code(s): 61311-481-10 | 1.35 ml of ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml of xylazine (20 mg/ml) are diluted in 12.0 ml of 0.9% saline solution |
| Ketamine | Vedco | KetaVed-10ml, NADA #200-029, NDC Code(s): 50989-161-06 | 1.35 ml of ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml of xylazine (20 mg/ml) are diluted in 12.0 ml of 0.9% saline solution |
| Ophthalmic gel | Fisher Scientific | NC0550805 | |
| Burret clips | Fisher Scientific | NC9268369 | |
| Feather surgical blade | Fisher Scientific | NC9032736 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 19-898-919 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14815203 | |
| Hamilton™ Small Hub Removable Needles (33 Ga) | Fisher Scientific | 14816206 | |
| Cordless Micro Drill | Fisher Scientific | NC9089241 | |
| Dermabond Dermal Adhesive | Fisher Scientific | NC0690470 | |
| (±)-1-(2,5-Dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane hydrochloride (DOI) | Sigma-Aldrich | 42203-78-1 | Dissolved in 0.9% saline solution to the concentration of 2.0 mg/kg |
References
- Fribourg, M., et al. Decoding the Signaling of a GPCR Heteromeric Complex Reveals a Unifying Mechanism of Action of Antipsychotic Drugs. Cell. 147 (5), 1011-1023 (2011).
- Gonzalez-Maeso, J., et al. Identification of a serotonin/glutamate receptor complex implicated in psychosis. Nature. 452 (7183), 93-97 (2008).
- Gonzalez-Maeso, J., et al. Hallucinogens Recruit Specific Cortical 5-HT(2A) Receptor-Mediated Signaling Pathways to Affect Behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
- Gonzalez-Maeso, J., et al. Transcriptome fingerprints distinguish hallucinogenic and nonhallucinogenic 5-hydroxytryptamine 2A receptor agonist effects in mouse somatosensory cortex. J Neurosci. 23 (26), 8836-8843 (2003).
- Moreno, J. L., Holloway, T., Albizu, L., Sealfon, S. C., Gonzalez-Maeso, J. Metabotropic glutamate mGlu2 receptor is necessary for the pharmacological and behavioral effects induced by hallucinogenic 5-HT2A receptor agonists. Neurosci Lett. 493 (3), 76-79 (2011).
- Moreno, J. L., et al. Identification of Three Residues Essential for 5-HT2A-mGlu2 Receptor Heteromerization and its Psychoactive Behavioral Function. J Biol Chem. 287, 44301-44319 (2012).
- Geyer, M. A., Vollenweider, F. X. Serotonin research: contributions to understanding psychoses. Trends Pharmacol Sci. 29 (9), 445-453 (2008).
- Nichols, D. E.
- Hanks, J. B., Gonzalez-Maeso, J.
- Fiorella, D., Rabin, R. A., Winter, J. C. Role of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in the stimulus effects of hallucinogenic drugs. II: Reassessment of LSD false positives. Psychopharmacology (Berl). 121 (3), 357-363 (1995).
- Vollenweider, F. X., Vollenweider-Scherpenhuyzen, M. F., Babler, A., Vogel, H., Hell, D. Psilocybin induces schizophrenia-like psychosis in humans via a serotonin-2 agonist action. Neuroreport. 9 (17), 3897-3902 (1998).
- Moreno, J. L., Sealfon, S. C., Gonzalez-Maeso, J. Group II metabotropic glutamate receptors and schizophrenia. Cell Mol Life Sci. 66 (23), 3777-3785 (2009).
- Kurita, M., et al. HDAC2 regulates atypical antipsychotic responses through the modulation of mGlu2 promoter activity. Nat Neurosci. 15 (9), 1245-1254 (2012).
- Kurita, M., et al. Repressive Epigenetic Changes at the mGlu2 Promoter in Frontal Cortex of 5-HT2A Knockout Mice. Mol Pharmacol. 83 (6), 1166-1175 (2013).
- Rives, M. L., et al. Crosstalk between GABAB and mGlu1a receptors reveals new insight into GPCR signal integration. Embo J. 28 (15), 2195-2208 (2009).
- Milligan, G. The Prevalence, Maintenance and Relevance of GPCR Oligomerization. Mol Pharmacol. (84), Epub ahead of print 158-169 (2013).
- Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacol Rev. 66 (2), 413-434 (2014).
- Gonzalez-Maeso, J. GPCR oligomers in pharmacology and signaling. Mol Brain. 4 (1), 20 (2011).
- Gonzalez-Maeso, J. Family a GPCR heteromers in animal models. Front Pharmacol. 5, 226 (2014).
- Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 12060-12065 (2011).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
- Fonseca, J. M., Lambert, N. A. Instability of a class a G protein-coupled receptor oligomer interface. Mol Pharmacol. 75 (6), 1296-1299 (2009).
- Hern, J. A., et al. Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2693-2698 (2010).
- Hlavackova, V., et al. Sequential inter- and intrasubunit rearrangements during activation of dimeric metabotropic glutamate receptor 1. Sci Signal. 5 (237), 59 (2012).
- Irannejad, R., et al. Conformational biosensors reveal GPCR signalling from endosomes. Nature. 495 (7442), 534-538 (2013).
- Calebiro, D., Nikolaev, V. O., Persani, L., Lohse, M. J. Signaling by internalized G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 31 (5), 221-228 (2010).
- Celada, P., Puig, M. V., Diaz-Mataix, L., Artigas, F. The hallucinogen DOI reduces low-frequency oscillations in rat prefrontal cortex: reversal by antipsychotic drugs. Biol Psychiatry. 64 (5), 392-400 (2008).
- Béïque, J. -C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (23), 9870-9875 (2007).
