Summary
この記事では、GPCRヘテロマーの形成を必要とする行動アッセイをテストするために、マウスの前頭皮質にウイルスベクターを注入する方法について説明します。
Introduction
そのようなLSD、サイロシビンやメスカリンなどの幻覚剤は、人間の意識、認知と感情7-9に大きな変化を引き起こします。セロトニンの不活性化は、遺伝的または薬理学的のいずれかの方法により、5-HT 2A受容体のシグナル伝達は、両方の齧歯類モデル3,10、およびヒト11で幻覚剤に著しく減衰行動反応を引き起こします。幻覚剤は、他の受容体サブタイプ8に結合するが、5-HT 2A受容体は、これらの化学物質の固有の行動活性に必要と考えられています。
グループII代謝型グルタミン酸受容体（ すなわち 、mGlu2およびmGlu3）は幻覚剤の分子機構に関するかなりの注目の対象と精神病12の基礎となる彼らの重要な役割となっています。これまでは、mGlu2タンパク質の発現なしでのマウス（mGlu2-KOマウス）はHALの細胞や行動への影響に鈍感であることが実証されていますlucinogens 5。また、5-HT 2AおよびmGlu2受容体は、セロトニンおよびグルタミン酸リガンドが生細胞1,2のGタンパク質結合のパターンを調節し、それを通して、特定のヘテロマー複合体を形成することが示唆されています。
構造的には、膜貫通（TM）ドメイン4およびmGlu2の5は、5-HT 2A受容体5とヘテロマー形成に重要な役割を果たしています。さらに、さらなる調査がmGlu2のTM4の細胞内の端部に位置する3つの残基が、細胞を6生体内5-HT 2A -mGlu2レセプターヘテロを形成するのに必要であることを実証しました。
異種発現系で観察されたこれらの知見に基づいて、ここでは、5-HT 2Aとの間のヘテロマー形成するかどうかをテストするために、野生型mGlu2およびmGlu2-KOマウスの前頭皮質におけるmGlu2 / mGlu3キメラ構築物のHSV媒介表現の使用を記載していますそして、mGlu2はのために必要です幻覚5-HT 2A受容体アゴニストによって誘導される頭部攣縮挙動。
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Protocol
注：動物の飼育や心配事のためのすべての手順は、マウントサイナイ医科大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）規則に従って行いました。作業中は滅菌手袋を使用してください。
1.薬剤およびウイルスの準備
- 医薬品の準備
- 0.9％の食塩水の12.9ミリリットルで100 mg / mlでケタミンおよび20mg / mlのキシラジンの0.75ミリリットルの1.35ミリリットルを溶解することにより15.0ミリリットルのケタミン/キシラジン麻酔薬を準備します。溶液を十分に混合します。
- ウイルス調製物
- mGlu2のクローンを作成し、mGlu2ΔTM4Nは、標準的なプロトコルは、以前に6を説明し、次のシストロン性単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクター内に構築します。以前6,13,14に記載されているようにウイルス粒子をパッケージ化します。残基の置換アラ-677 4.40、mGlu2でのAla-681 4.44およびAla685 4.48 Ser686 4.40、pHについてE690 4.44とのGly-694 4.48 mGlu3（HA-mGlu2ΔTM4N）に以前6に記載されています。
注：これは、以前にキメラ構築HA-mGlu2ΔTM4Nが無傷のGタンパク質依存6シグナル伝達と細胞膜で発現することが示されました。 - C使用しないときには-80℃でウイルスベクターを保管してください。氷の上でウイルスベクターを解凍してから、10μlのアリコートに分注し。外科的手順については、氷上に保ちます。
- mGlu2のクローンを作成し、mGlu2ΔTM4Nは、標準的なプロトコルは、以前に6を説明し、次のシストロン性単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクター内に構築します。以前6,13,14に記載されているようにウイルス粒子をパッケージ化します。残基の置換アラ-677 4.40、mGlu2でのAla-681 4.44およびAla685 4.48 Ser686 4.40、pHについてE690 4.44とのGly-694 4.48 mGlu3（HA-mGlu2ΔTM4N）に以前6に記載されています。
2.手術
- 手術の準備
- マウスを計量し、（詳細については、1.1.1を参照）をケタミン/キシラジンのカクテルの適切な用量でマウスを注入。
- 適切に麻酔をかけた場合、疼痛応答のための足と尾を絞る参照するには、マウスをチェックし、応答を誘発することができない場合は、マウスが適切に麻酔されます。
- バリカンを使用して、鼻の先端に頭蓋底からマウスの頭を剃ります。マウスAFに眼科ゲルを適用しますマウスの失明を防ぐためにterward。
- 定位フレーム上にそれぞれ注射器をロードします。彼らは10度法線から離れているように、そして、定位フレームの各アームの垂直部分を傾けます。針がお互いに直面しているように、アームが傾いていることを確認してください。
- 70％エタノールで針を充填することにより、各注射器を清掃してください。注射器がクリーンであることを確実にするために、針に少なくとも3回を埋めます。
- 針が洗浄された後、二重蒸留H 2 Oで針を充填することによって針をフラッシュフラッシュたら、二重蒸留H 2 Oの1.3μlの各針を埋めます二重蒸留H 2 Oの0.3μLを解放するために、シリンジのプランジャーをねじります針の先端での水のビーズは、慎重に水を拭き取る場合。何も注射器から出てきていない場合は、完全にダウンしてプランジャーを押し、その後、注射器の洗浄を繰り返します。
- 水を充填した後、次いで、シリンジを充填注射器を引き上げ空気の0.5μlの。
- 空気や水が注射器に入ると、慎重にウイルス液の1.3μlのシリンジを埋めます。この時点で、シリンジ内の総容量は2.8μlであることを確認してください。再びウイルスの0.3μLを解放するために、注射器の先端をねじります。針の先端の液体ビーズは、慎重に液体を拭き取る場合。何も注射器から出てきていない場合は、完全にダウンしてプランジャーを押し、その後、注射器の洗浄を繰り返します。
- 手術
- 頭蓋骨が水平かつ平坦になるように、定位フレームを調整することを確認して、定位フレームにマウスを接続します。露出した頭皮にpovodine - ヨウ素を適用します。メスを用いて、露出した剃ったエリア内の頭蓋骨の正中線に沿って矢状切開を行います。その後、頭蓋骨が露出したままであることを確認するために切開部位の皮膚にビュレットクランプを取り付けます。
- の縫合糸を露出させるために骨膜を溶解除去するH 2 O 2を使用して頭蓋骨。今ブレグマおよび縫合糸が見えること、頭蓋骨が水平であることを確認するために、定位フレームを調整するようにしてください。
- ブレグマと注射器の針の先端の位置を合わせ、ブレグマの座標を記録します。針が挿入されようとしているの座標を計算します。
- 吻側-Cauldal（RC）面については、記録されたRCのブレグマ座標（ブレグマから1.6）に1.6ミリメートルを追加します。背腹（DV）面については、記録されたDVのブレグマ座標（ブレグマから-2.4）から2.4ミリメートルを引きます。
- 最後に、内側側横方向（ML）面のために、記録されたMLのブレグマ座標（ブレグマから2.6）に2.6ミリメートルを追加します。これは二国間の注射であるように、すべての座標は、左右両方の座標を記録するようにしてください。
- 希望の座標に針を持参してください。針を挿入し、ドリルで、マークされた領域をドリルダウンしようとしている場所の場所をマークします。
- 綿の先端アプリケータのwiと余分な血液や骨片を離れPE。
- 針の先端は、脳の表面に触れている頭蓋骨に針を持参してください。その後、ゆっくりとそれらを下げる目的の座標に針を下げます。
- 針は、所望の座標になったら、ゆっくりと（合計0.5μLで）5分にわたって毎分針0.1μlとプランジャーをねじることによって、注射器の内容物を注入します。
- 注入が行われた後、別の5分間の皮質に注射器を残します。
- アップクローズ/ケア
- 着実に、ゆっくりとマウスの皮質から針を外します。そして、定位フレームからマウスを削除します。
- 切開部から皮膚のベースフラップにシアノアクリレート（皮膚接着剤）を塗布した後、ピンセットで皮膚のフラップをつかみ、それらを一緒に配置します。
- シアノアクリレートが乾燥することができます。加熱パッドの上にケージにマウスを置きます（加熱パッドはオプションです外科場合それ以外の場合は不要） - iCalのスイートは、37℃の室温下に保たれています。寝具は、手術部位に付着しないことを確認するために、ペーパータオルの上にマウスを置くようにしてください。
- 処置後60分 - 外科処置の長さに応じて、マウスが30以内に麻酔から外れていることを確認してください。手術後、動物はそれ自身のケージに入れ、それを回復するためにその部屋に戻る前に、意識的になるまで監視されています。彼らは脳の生化学的経路の一部を変更することによって、私たちの実験の結果を変更することができるので、無鎮痛薬は、手術後に使用されていません。しかし、彼らは手術の日に、麻酔から回復するまで、動物が監視され、感染および痛み/苦痛の評価の徴候について毎日術後。
3.ヘッド単収縮応答実験
- セットアップ
- 3日stereota後 - 2、午前10:00と午後2:00の間のすべての行動試験を実施ウイルス粒子のCTIC注射。
- ディゾルブ（±）-1-（2,5-ジメトキシ-4-ヨードフェニル）2.0ミリグラム/ kgの0.9％生理食塩水に-2-アミノプロパン塩酸塩（DOI）。また、0.9％生理食塩水溶液を調製。
- 任意の寝具なしホームケージ（28×18×15センチ）を準備し、三脚を使用して、ビデオカメラのビューが直接ホームケージの上にあるようにカメラを調整します。
- 実験の開始に先立って、少なくとも4時間、部屋にマウスを慣らします。
- ヘッド単収縮を記録するビデオカメラを設定します。
- 実験
- それはホームケージの真上になるようにカメラを置きます。全体のホームケージが視野に入るようにカメラを調整します。
- マウスを計量し、0.9％生理食塩水またはDOI（0.01ミリリットル/ g）のいずれかの適切な用量で腹腔内にマウスを注入します。注：マウスは25グラムの重量を量る場合、0.25ミリリットルの全容積に用量を投与。
- foのホームケージに戻って各マウスを置きますR 10分間。 10分後、空のホームケージの中央にマウスを置いて、カメラの視野内に死角がないことを確認します。ビデオカメラを押してレコード。部屋のままにしておきます。
注：マウスの動きやその中の様々な行動反応（。。。頭がけいれん、耳の傷などは DOIによって誘発される行動応答の完全なリストについてのゴンザレス-Maeso ら 2007補足データテーブル1を参照してください）3、のために記録されます30分。したがって、記録された視野内に死角が存在しないことが重要です。 - 30分には元のホームケージにバックカメラと場所マウスの録音を停止した後。各マウスについて、このプロセスを繰り返します。
- レビュー
- テープは、マウスの実験条件に盲目各審判のレビューを持っている）（ すなわち 、ヘッドの間に使用される薬剤は、実験や頭蓋内注射時に使用されるウイルスをけいれん）。手動ですべてのヘッドがthrougけいれん記録ビデオハウト。
注：ヘッド単収縮は、マウス（補足ビデオ）が実施し、迅速な振とうヘッドの動きとして定義されています。 - 各マウスについて、ブラインド審判の合計3からの最終的なHTR応答を平均します。実験条件によってその後のグループ、これらの値を、統計分析を行う（ すなわち 、t検定またはANOVA）。
- テープは、マウスの実験条件に盲目各審判のレビューを持っている）（ すなわち 、ヘッドの間に使用される薬剤は、実験や頭蓋内注射時に使用されるウイルスをけいれん）。手動ですべてのヘッドがthrougけいれん記録ビデオハウト。
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Representative Results
以前の知見は、ヘッド単収縮マウスの行動応答を確実かつロバスト幻覚剤によって誘発され、それは、5-HT 2A -KOマウス3には存在しないことを示しています。また、DOIとLSD幻覚の5-HT 2Aアゴニストによって誘発される頭部攣縮応答が有意mGlu2-KOマウス5に減少したことが示されました。しかし、以前の知見は、説得力の5-HT 2AおよびmGlu2が生きているマウスではそのようなものが未解決のままであったように、この構造的配置がふるまうかどうか、1,2,15トランスフェクトされた細胞においてin vitroでのヘテロマー複合体として組み立てられていることを示しているものの。完全にこのマニピュレータかどうかを調べるために、mGlu2-KOマウスの前頭皮質におけるmGlu2またはmGlu2ΔTM4Nのいずれかの発現を幻覚5-HT 2A受容体アゴニストにより誘導された精神のような効果で5-HT 2A -mGlu2受容体ヘテロの役割を理解するために、ピュレーションは、動作を制御します。
マウスは、単独で、緑色蛍光タンパク質（GFP）及びmGlu2またはmGlu2ΔTM4Nか、GFPを発現するバイシストロン性HSVのイントラ前頭皮質の注射を受けました。まず、ウイルス、マウス前頭皮質におけるmGlu2またはmGlu2ΔTM4N（ 図1Aおよび1B）を過剰発現することが確認されました。以前に5を実証されているように、DOIによって誘導された頭部単収縮挙動は、空のベクターHSV-GFPを注入しmGlu2-KOマウスには存在しませんでした。特に、幻覚の5-HT 2AアゴニストDOIによって誘導されたヘッド単収縮応答は過剰発現mGlu2をmGlu2-KOマウスで救出されたが、mGlu2ΔTM4N、前頭皮質にGFP（ 図1C）を発現する動物で見られるものと比較しないように。まとめると、これらの知見は、前頭皮質における5-HT 2A -mGlu2受容体複合体は、精神病のような状態を調節するために重要であることを示唆しています。
受容体ヘテロとしてmGlu2の図1.発現。5-HT 2Aを有する受容体としてmGlu2の発現は、幻覚薬によって誘発される精神病のような動作のために必要です。 （A）前頭皮質におけるHSV媒介導入遺伝子発現の代表的な画像。また、GFPを発現するHSV-mGlu2は、前頭葉に注入し、そしてGFP発現を免疫細胞化学、スケールバー、200-UMによって明らかにしました。 （B）mGlu2-KOマウスのマウスの前頭皮質における導入遺伝子の発現をHSV媒介および抗mGlu2反応性をウェスタンブロッティングによって測定しました。 mGlu2受容体に対する一次抗体の特異性は、以前にノックアウトマウス6で確認されています。代謝調節型グルタミン酸受容体は、共有結合したホモ二量体を形成するGPCRです。私たちは、単量体（100 kDaの）6としてmGlu2の免疫反応性を測定しました。 （Cは ら （2012年）6から変更された表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
補足ビデオ1.ヘッド単収縮応答。 （右クリックしてダウンロード）。 CD-1 WTマウスは、ヘッド単収縮応答（*後の行動が誘発さ）引き出すために（壁が2ケージの間にブラックアウト）が2.0mg / kgのDOIを注射し、ケージに入れました。
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Discussion
一緒にmGlu2-KOマウス5の前の所見と、培養細胞において5-HT 2A -mGlu2受容体複合体を形成しないmGlu2およびmGlu2 / mGlu3キメラ構築物を用いた結果は、5-HT 2A -mGlu2ヘテロマー受容体複合体ことを示唆していますマウスの前頭皮質は、LSDのような幻覚5-HT 2A受容体アゴニストによって頭部攣縮挙動を誘発するために必要とされます。この方法の制限は、それが天然の組織内の細胞下レベルで近い分子近接性を測定しないということです。また、注目すべき種々の重要な点があります。注射後4日目 - マウスは、HSVウイルスベクターを注入されているため、実験を実行すること時間枠は2です。ウイルスベクターの位置および発現は、これ以上の4日以内の初期注射後の切片脳の免疫蛍光染色で確認する必要があります。マウスここで座標が一致していないか、またはウイルスベクターをべきで発現しません彼らはmGlu2またはmGlu2ΔTM4Nを発現しないように、実験データから除外されます。定位手術も重要である後頭創傷の不適切な決算は、 インビボ実験と免疫蛍光染色の両方で問題が発生する可能性があり、感染につながることができますように、気になります。 （t-検定を交互にオープンフィールド、 など ） -ウイルス粒子の注射後4最後に、任意の行動パラダイムを定位注射した後であれば、それが2以内であるように使用することができます。ここでも、座標および発現は、免疫蛍光法により確認すべきです。
生きた細胞内のホモポリマーおよび/ またはヘテロマーなどのGPCRの機能は現在十分に16-18を確立されている概念。しかし、いくつかの進歩にもかかわらず、多くの研究が動物全体モデル19におけるGPCRのヘテロマー複合体の正確な役割（複数可）を定義するために必要とされます。小動物の深部組織内のタンパク質 - タンパク質の物理的な近接性を調査するために、このようなBRETおよび/またはFRETイメージングなどのアプローチモデルは、被験者20生体内GPCRのヘテロマーの機能的役割の理解を高めるための手段を提供することができます。ネイティブまたは修正された膜貫通タンパク質のいずれかのGPCRのHSV媒介発現を使用して、GPCRの機能と相互作用を評価するためのin vivoモデルを提供します。
げっ歯類モデルにおいてさらなる研究がまた21-23、構造的再編成そのコンポーネント24、および受容体内在25,26後の電位Gタンパク質結合の間のGPCRヘテロマーの安定性とライフタイム（形成と解離）を調べるために必要とされています。細胞のシグナル伝達および機能におけるGPCRの基本的な役割を考えると、この領域は興味深い基本と翻訳研究につながる可能性がある可能性が高いと思われます。
さらに調査を定量的に前のSTUと一緒に、ヒトとマウスのCNSにおける両受容体の超微細構造の共局在を特徴づけるために必要とされるが、説得力の電気生理学を示す金型、細胞、およびマウスモデルにおける幻覚剤によって誘発される行動反応は、3,27,28、5-HT 2A受容体を発現する皮質錐体ニューロンに固有であり、ここに記載HSV媒介発現のアプローチを用いて得られた知見は示唆していますマウスの前頭皮質における5-HT 2AおよびmGlu2受容体との間のヘテロマー形成が幻覚5-HT 2A受容体アゴニストDOIによって誘導された頭部単収縮精神病のような動作のために必要とされます。
mGlu2のHSV媒介発現が、mGlu2ΔTM4Nは、mGlu2-KOマウスの前頭皮質ニューロンに幻覚5-HT 2A受容体アゴニストDOIによって誘導された頭部単収縮挙動を救うません。前臨床試験は、GPCRヘテロマーの行動表現型を評価するために、この翻訳ツールは有利かもしれません。
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Acknowledgments
NIH R01MH084894は、この研究の資金調達に参加しました。我々は、博士に感謝したいと思います。マウスの寄付と、この作品の撮影時に、その手術や行動施設の利用のためのマウントサイナイ医科大学でヤスミンHurd氏とスコット・ルッソ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mGlu2 bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| mGlu2ΔTM4N bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| GFP bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector | MIT Core | mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) | |
| Xylazine | Lloyd | List no. 4811-20ml, NADA #139-236, NDC Code(s): 61311-481-10 | 1.35 ml of ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml of xylazine (20 mg/ml) are diluted in 12.0 ml of 0.9% saline solution |
| Ketamine | Vedco | KetaVed-10ml, NADA #200-029, NDC Code(s): 50989-161-06 | 1.35 ml of ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml of xylazine (20 mg/ml) are diluted in 12.0 ml of 0.9% saline solution |
| Ophthalmic gel | Fisher Scientific | NC0550805 | |
| Burret clips | Fisher Scientific | NC9268369 | |
| Feather surgical blade | Fisher Scientific | NC9032736 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 19-898-919 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14815203 | |
| Hamilton™ Small Hub Removable Needles (33 Ga) | Fisher Scientific | 14816206 | |
| Cordless Micro Drill | Fisher Scientific | NC9089241 | |
| Dermabond Dermal Adhesive | Fisher Scientific | NC0690470 | |
| (±)-1-(2,5-Dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane hydrochloride (DOI) | Sigma-Aldrich | 42203-78-1 | Dissolved in 0.9% saline solution to the concentration of 2.0 mg/kg |
References
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