代替プロモーターの使用およびマウスBcrp1の転写調節を発見する方法
Summary
例として、マウスABCトランスポーターBcrp1（ABCG2）を用いて、 イン・シリコプロトコルは、マウス組織において発現される遺伝子に代替プロモーターの使用を検出するために、レポーターアッセイを用いて同定された代替的なプロモーターの機能性を評価するために提示されています。
Abstract
通常非翻訳 – – 第一のエキソンの異なる組織における遺伝子発現は、しばしば、ユニークでmRNAの合成をもたらす代替的なプロモーターによって制御されます。 E1U、E1A、E1B、およびE1C：Bcrp1（ABCG2）、ABCトランスポーター乳癌耐性タンパク質（BCRP、ABCG2）のマウスオルソログは、生産対応する4つの代替最初のエクソンによって指定された少なくとも4つの代替のプロモーターを持っています。本明細書において、 インシリコプロトコルはBcrp1ための別のプロモーターの使用を予測するために提示されています。さらに、レポーターアッセイ法は、代替プロモーターのためのレポーター構築物を生成するために上流に同定されている代替の第一エキソンの推定プロモーターの機能性を決定するために記載されています。
Introduction
もっとヒト遺伝子の半分以上が、代替プロモーター1により調節されます。各代替プロモーターは、他の代替的なプロモーターのものと異なっていてもよい調節要素を含むことができます。つの組織に利用されるプロモーター（複数可）は、別の組織で使用されるものと異なってもよいです。例えば、所定のシグナル伝達経路の活性化はつの組織において利用遺伝子のための代替のプロモーターを誘発する、まだに影響を及ぼさない、または別の組織に利用されるのと同じ遺伝子についての別個の代替プロモーターを抑制することができる可能性があります。
Bcrp1遺伝子の発現は、別のプロモーターにより支配されます。 Bcrp1は、ヒト乳癌耐性タンパク質（BCRP）遺伝子のマウスオルソログです。 BCRPは、ATP結合カセット（ABC）トランスポーター、正式に指定さABCG2 2、3です。頂端細胞膜タンパク質として、BCRP / Bcrp1機能は、天然および生体異物基質の広範囲を流出します<suP> 3、4。 12 –ヒトとマウスでは、BCRP / Bcrp1は非常に、肝臓（毛細胆管）、腸、および腎臓、ならびに胎盤、脳や精巣2などの血液-組織障壁を持つ器官、5などの薬理学的に関連する器官で発現しています。がん幹細胞を含む造血細胞および他の幹細胞におけるBCRP / Bcrp1の発現は、生体異物および癌化学療法薬3に、これらの細胞の耐性を付与することができます。
初期の研究では、正常および新生物細胞におけるBCRP発現の調節を理解するために、BCRP mRNAの5 'cDNA末端の迅速増幅（5'-RACE）分析は、その正確な転写開始部位13を決定しました。だけでなく、見られる複数の転写開始部位がありました。また、BCRPで未翻訳である第一エクソン、の3つの代替の形態があったが発生しました。これらの代替最初のエクソン – 指定のE1a、E1bを、E1Cは – 人間の種々の組織において異なって発現させました。二つの追加の第1エクソン変異体は、BCRP 13の第2エクソンを用いてヒトESTデータベースのBLAST検索で発見されました。 4試合は、上流E1uと命名したエクソン2から第一エキソン> 70キロバイトを明らかにしました。 4その他の試合ではE1- 13と命名した完全に第一エクソンを欠いていたBCRPのmRNAを、明らかにしました。 代替リーダーエクソンの存在は、代替的なプロモーターの使用14の現れであると考えられます。
マウスでは、Bcrp1の4代替最初のエキソンは異なるマウス組織におけるBCRP 1転写を支配する代替プロモーターに対応することができることが記載されています。これらのエキソン/プロモーターはE1U、E1A、E1BとE1Cを指定し、約70、58、15、および上流Bcrp1エクソン2 5、15から5キロバイトに位置しています。 E1A mRNAのアイソフォームはムリンで支配的であることが見出されましたE E1Bアイソフォームは、骨髄5、15マウス腸、胎児肝臓細胞、および赤血球前駆細胞において発現されたのに対し、造血幹細胞、心臓、肺、脾臓、および脳。上流E1Bからのプロモーターが、ホスホサイクリックAMP応答エレメント結合タンパク質（P-CREB）とその代替に固有のCREB応答要素によって、少なくとも部分的に調節、マウス腸内Bcrp1転写を支配する主要な代替プロモーターであることが示されましたBcrp1プロモーター16。 E1CのmRNAアイソフォームは主として成体マウスの肝臓および腎臓5で表されます。 E1Uアイソフォームは、それが優勢なアイソフォームは5発現しているマウスの精巣を除き、試験したほとんどの組織では検出不能です。 （それは後期精子細胞4を保護することができる輸精内皮、中）体細胞（内皮タイトジャンクション、管周囲筋様細胞、およびセルトリ細胞）と生殖細胞の両方で発見されたBcrp1は、ラットの精巣で発現しました。 REGイオンは、上流E1Uからステロイド合成因子1（SF-1）5のための機能的応答要素が含まれています。 Bcrp1 mRNAおよびタンパク質は、著しくマウスセルトリ細胞におけるBcrp1発現はSF-1 5によって制御されることを示唆し、セルトリ細胞特異的SF-1ノックアウトマウスの精巣で低減されます。
プロトコルは、インシリコ Bcrp1の代替最初のエクソンを検出し、識別された代替最初のエクソンから上流の推定プロモーターのためのルシフェラーゼ・レポーターアッセイを確立するために、詳細な方法を提示しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示された方法および代表的な結果の大部分は2013年5に出版された「マウス精巣におけるB CRP1の転写は上流のステロイド合成因子-1によって調節される新規の第一エキソン（E1U）、のプロモーターによって制御されている」と題された前作に記載されていますここで示されている代表的な結果に加えて、前の紙は、5'-RACE PCRおよびRT-PCR法を用いた代替的な第一エクソンの利用?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、退役軍人省からダグラスD.ロスへとアリフ・フセインにメリットレビュー賞によってサポートされていました。
Materials
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep – isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
References
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