طرق لاكتشاف المروج البديل الاستخدام وتنظيم الترانسكربتي من الفئران Bcrp1
Summary
مع ABC نقل الفئران Bcrp1 (Abcg2) على سبيل المثال، تعرض البروتوكولات في سيليكون للكشف عن استخدام المروج بديل في الجينات وأعرب في الأنسجة الماوس، وتقييم الأداء الوظيفي من المروجين بديل تحديدها باستخدام المقايسات مراسل.
Abstract
وغالبا ما يسيطر التعبير الجيني في أنسجة مختلفة من قبل المروجين البديل الذي يؤدي في تركيب مرنا مع فريدة من نوعها – عادة غير مترجمة – الإكسونات الأولى. Bcrp1 (Abcg2)، وorthologue الفئران من ABC نقل الثدي البروتين السرطان المقاومة (BCRP، ABCG2)، وأربعة على الأقل المروجين البديلة التي يتم تحديدها من قبل أربعة الإكسونات الأولى البديلة المناظرة التي تنتجها: E1U، E1A، E1B، وE1C. هنا، يتم عرض البروتوكولات في سيليكون للتنبؤ استخدام المروج بديل للBcrp1. وعلاوة على ذلك، وصفت وسائل مراسل فحص لإنتاج بنيات مراسل المروجين بديل وتحديد وظيفة من المروجين المفترض المنبع من الإكسونات الأولى البديلة التي يتم تحديدها.
Introduction
أكثر من نصف الجينات البشرية التي ينظمها المروجين البديل 1. يمكن أن تحتوي على كل المروج البديل العناصر التنظيمية التي قد تكون مختلفة عن تلك الموجودة في المروجين بديل آخر. المروج (ق) المستخدمة في نسيج واحد قد تختلف عن تلك المستخدمة في أنسجة أخرى. على سبيل المثال، فمن الممكن أن تفعيل مسار إشارات معينة قد تؤدي إلى مروج بديل لجين المستخدمة في نسيج واحد، ولكن ليس لها أي أثر أو قمع المروج بديل مستقل لنفس الجين الذي يستخدم في أنسجة أخرى.
يخضع التعبير عن الجينات Bcrp1 قبل المروجين بديل. Bcrp1 هو orthologue الفئران من الجين الثدي البشري السرطان المقاومة البروتين (BCRP). BCRP هو ملزم ATP كاسيت (ايه بي سي) نقل، وعينت رسميا ABCG2 2 و 3. باعتبارها قمي بلازما بروتين الغشاء، BCRP / وظائف Bcrp1 إلى هروب رأس المال مجموعة متنوعة واسعة من ركائز الطبيعية وأجنبي بيولوجيا <suP> 3، 4. في البشر والفئران، وأعرب عن BCRP / Bcrp1 غاية في الأجهزة المختصة في صناعة الأدوية مثل الكبد (الصفراء نفيق) والأمعاء، والكلى، وكذلك أجهزة بحواجز الدم الأنسجة مثل المشيمة والمخ والخصية 2، 5-12. التعبير عن BCRP / Bcrp1 في للدم والخلايا الجذعية الأخرى، بما في ذلك الخلايا الجذعية السرطانية، قد تمنح مقاومة هذه الخلايا إلى الاكسيوبيوتك والسرطان أدوية العلاج الكيميائي 3.
في العمل في وقت مبكر لفهم تنظيم التعبير BCRP في الخلايا الطبيعية والأورام، تم تنفيذ 5 "التضخيم السريع لغايات كدنا] (5'-RACE) تحليل BCRP مرنا لتحديد موقع بداية النسخي المحدد لها 13. لا لم يكن هناك سوى عدة مواقع بداية النسخي وجدت. واجه أيضا كانت ثلاثة أشكال بديلة من اكسون الأول، وهو غير مترجمة في BCRP. هذه الإكسونات الأولى بديلة – المعين E1A، E1B، E1c – وأعرب عن مختلف في مجموعة متنوعة من الأنسجة البشرية. تم اكتشاف نوعين مختلفين إضافية اكسون الأولى في البحث انفجار في قاعدة البيانات EST الإنسان باستخدام اكسون الثاني من BCRP 13. كشفت أربع مباريات في أول اكسون> 70 كيلوبايت المنبع من اكسون 2 التي كانت مخصصة E1u. كشفت أربع مباريات أخرى BCRP مرنا التي تفتقر الى اكسون الأول تماما، والتي كانت مخصصة E1- 13. ويعتبر وجود الإكسونات زعيم بديلة ليكون مظهرا من مظاهر استخدام المروج بديل 14.
في الفئران، وصفت أربعة الإكسونات الأولى بديلة للBcrp1 التي قد تتوافق مع المروجين البديلة التي تحكم Bcrp 1 النسخ في أنسجة مختلفة الماوس. وتتم تسمية هذه الإكسونات / المروجين E1U، E1A، E1B وE1C، وتقع حوالي 70، 58، 15، و 5 كيلو بايت المنبع من Bcrp1 اكسون 2 5، 15. تم العثور على الإسوي E1A مرنا هو السائد في murinالبريد الخلايا الجذعية المكونة للدم والقلب والرئة والطحال، والدماغ، في حين أعرب عن الإسوي E1B في الأمعاء الماوس، وخلايا الكبد الجنين، والخلايا محمر السلائف في نخاع العظام 5، 15. وقد أظهرت المروج المنبع من E1B أن يكون المروج البديل الرئيسي الذي يحكم النسخ Bcrp1 في الأمعاء الماوس، ينظم على الأقل جزئيا، من خلال الفوسفات-دوري-AMP عنصر استجابة بروتين (ف CREB) وعنصر استجابة CREB فريدة من نوعها لهذا البديل Bcrp1 المروج 16. يتم التعبير عن الإسوي E1C مرنا في الغالب في الكبد الفئران الكبار والكلى 5. شكل الإسوي E1U غير قابل للكشف في معظم الأنسجة اختبار باستثناء الخصية في الفئران، حيث هو شكل الإسوي الغالبة أعرب 5. وأعرب Bcrp1 في الخصيتين الفئران وجدت في كل جسدية (تقاطعات البطانية ضيقة، خلايا شبه عضلية peritubular، وخلايا سيرتولي) والخلايا الجرثومية (في البطانة المنوية، حيث حفظه نطفة أرومية في وقت متأخر من المرحلة 4). ليموزينأيون المنبع من E1U يحتوي على عنصر استجابة وظيفية لالستيرويدي المنشأ عامل 1 (SF-1) 5. يتم تخفيض Bcrp1 مرنا والبروتين بشكل ملحوظ في الخصيتين من سيرتولي خلية محددة SF-1 الفئران خروج المغلوب، مما يوحي بأن Bcrp1 التعبير في خلايا سيرتولي الفئران تسيطر عليها SF-1 5.
البروتوكولات المعروضة أساليب التفاصيل للكشف عن الإكسونات الأولى بديلة للBcrp1 في سيليكون، وإقامة فحوصات مراسل القائم على وسيفيراز للمروجين المفترض المنبع من الإكسونات الأولى البديلة المحددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفت معظم الأساليب والنتائج التمثيلية التي قدمت في أعمال سابقة بعنوان "يتم التحكم ب crp1 النسخ في الخصية الماوس بواسطة مروج المنبع من اكسون الرواية الأولى (E1U) التي تنظمها عامل 1 الستيرويدي المنشأ"، والتي نشرت في عام 2013 5 بالإضافة إلى نتائج تمثيلية يصور ه…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جوائز مراجعة الاستحقاق لدوغلاس د روس وعارف حسين من وزارة شؤون المحاربين القدامى.
Materials
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep – isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
References
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis–an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer’s brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5′ untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Promega. . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System – INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. . Quick Ligation Kit Protocol – M2200S. , (2014).
- Roche. . XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol – Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. . Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
