Métodos para descobrir Uso Promotor Alternativa e regulação da transcrição de Murino Bcrp1
Summary
Com o transportador ABC de murino Bcrp1 (ABCG2) como um exemplo, in silico protocolos são apresentados para detectar alternativos de utilização do promotor nos genes expressos em tecidos de ratinho, e para avaliar a funcionalidade dos promotores alternativos identificados utilizando ensaios de repórter.
Abstract
a expressão do gene em diferentes tecidos é frequentemente controlada por promotores alternativos que resultam na síntese de ARNm com exclusivos – normalmente não traduzidas – primeiros exões. Bcrp1 (ABCG2), o ortólogo de murídeo da mama ABC transporter Resistência cancro Proteína (BCRP, ABCG2), tem pelo menos quatro promotores alternativos que são designadas pelos quatro primeiros exões alternativos correspondentes produzidos: E1U, E1A, E1B, E1C e. Nisto, in silico protocolos são apresentados para predizer o uso alternativo promotor para Bcrp1. Além disso, os métodos de ensaio de repórter são descritos para produzir construções repórter para promotores alternativos e para determinar a funcionalidade de promotores putativos a montante do primeiro exões alternativos que são identificados.
Introduction
Mais de metade dos genes humanos são regulados por promotores alternativos 1. Cada promotor alternativa pode conter elementos reguladores que podem ser diferentes das de outros promotores alternativos. O promotor (es) utilizado num tecido podem ser diferentes daquelas usadas num outro tecido. Por exemplo, é possível que a activação de uma determinada via de sinalização pode desencadear o promotor alternativo para um gene utilizado em um tecido, mas não têm efeito sobre ou reprimir um promotor separado alternativa para o mesmo gene que é utilizado noutro tecido.
A expressão do gene é regulada pelo Bcrp1 promotores alternativos. Bcrp1 é o ortólogo de murídeo do gene humano da mama cancro da Resistência Proteína (BCRP). BCRP é um transportador de cassete de ligação a ATP (ABC), ABCG2 2, 3 designado formalmente. Como uma proteína da membrana plasmática apical, funções / Bcrp1 BCRP efluxo de uma grande variedade de substratos naturais e xenobióticos <sup> 3, 4. Em humanos e ratos, BCRP / Bcrp1 é altamente expresso em órgãos farmacologicamente relevantes, tais como o fígado (canalículos biliares), intestino e rins, bem como órgãos com barreiras sangue-tecido, como placenta, cérebro e testículos 2, 5 – 12. Expressão da BCRP / Bcrp1 em hematopoiético e outras células estaminais, incluindo cancro de células estaminais, pode conferir resistência dessas células a xenobióticos e fármacos quimioterapêuticos de cancro 3.
Em trabalho inicial de compreender a regulação da expressão BCRP em células normais e neoplásicas, 5 'amplificação rápida de extremidades de ADNc (5'-RACE) análise de ARNm BCRP foi realizado para determinar o seu local de início da transcrição exacta 13. Não só foram vários locais de início da transcrição encontrados; Também foram encontradas três formas alternativas do primeiro exão, o qual é em BCRP não traduzida. Estes primeiros exons alternativos – designadas E1a, E1b, E1C – foram expressos de forma diferente em uma variedade de tecidos humanos. Duas primeiras variantes de exão adicionais foram descobertos em uma pesquisa BLAST da base de dados EST humana usando o segundo exão do BCRP 13. Quatro partidas revelou um primeiro exão> 70 kb a montante do exão 2, que foram designados E1u; outras quatro partidas revelou mRNA BCRP que faltava um primeiro exão inteiramente, que foram designados E1 13. A presença de exões alternativos líder é considerado ser uma manifestação da utilização promotor alternativa 14.
Em ratinhos, quatro primeiros exões alternativos de Bcrp1 são descritos que podem corresponder aos promotores alternativos que governam a transcrição Bcrp 1 em diferentes tecidos de ratinho; estes exons / promotores são designados E1U, E1A, E1B e E1C, e estão localizados cerca de 70, 58, 15 e 5 kb a montante de Bcrp1 exão 2 5, 15. A isoforma de ARNm de E1A foi encontrado para ser predominante em Murine células-tronco hematopoiéticas, coração, pulmão, baço e cérebro, ao passo que a isoforma E1B foi expressa no intestino do rato, células de fígado fetal, e as células precursoras eritróides na medula óssea de 5, 15. O promotor a montante de E1B foi demonstrado que é o principal promotor alternativo que rege Bcrp1 transcrição no intestino do rato, regulada, pelo menos em parte, por fosfo-AMP-cíclico proteína elemento de resposta de ligação (p-CREB) e um elemento de resposta de CREB única para esse alternativa promotor Bcrp1 16. A isoforma ARNm E1C é predominantemente expresso no fígado de murino adulto e o rim 5. A isoforma E1U não é detectável na maioria dos tecidos testados excepto para testículo de murino, em que é a isoforma predominante expressa 5. Bcrp1 expressa em testículos de ratos é encontrado em ambos os somáticas (junções endoteliais apertadas, células mióides peritubulares e células de Sertoli) e células germinativas (no endotélio seminífero, onde ele pode proteger em estágio final spermatids 4). a rega montante do ião E1U contém um elemento de resposta funcional para esteroidogênica factor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 ARNm e proteína são marcadamente reduzida nos testículos dos ratinhos knockout de Sertoli específicos de células SF-1, sugerindo que a expressão em células de Sertoli Bcrp1 murino é controlado por SF-1 5.
Os protocolos apresentados métodos para detectar detalhe primeiros exões alternativos de Bcrp1 in silico, e para estabelecer ensaios de repórter de luciferase baseados em promotores putativos para a montante dos primeiros exões alternativos identificados.
Protocol
Representative Results
Discussion
A maioria dos métodos e os resultados representativos apresentados encontram-se descritos em trabalhos anteriores, intitulado "B transcrição crp1 no testículo do rato é controlada por um promotor a montante de um novo primeiro exão (E1U) regulado por factor 1 de esteroidogênica", que foi publicada em 2013 5 . para além dos resultados representativos descritos aqui, o trabalho anterior proporcionou estimativas de utilização exão primeira alternativa utilizando 5'-RACE PCR e RT…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por Mérito Revisão concessões para Douglas D. Ross e para Arif Hussain, do Departamento de Assuntos dos Veteranos.
Materials
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep – isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
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