שיטות לגלות אלטרנטיבי שימוש יזם ותקנת תעתיק של Murine Bcrp1
Summary
עם טרנספורטר murine ABC Bcrp1 (Abcg2) כדוגמא, ב-סיליקון פרוטוקולים מוצגים מזהים שימוש אמרגן חלופי גנים מתבטאים רקמות עכבר, כדי להעריך את התפקוד של היזמים החלופיים שזוהו באמצעות מבחני כתב.
Abstract
התבטאות גנים ברקמות שונות נשלטת לעתים קרובות על ידי יזמים חלופיים, לגרום תיצור mRNA עם ייחודי – אקסונים ראשון – בדרך כלל לא מתורגם. Bcrp1 (Abcg2), את orthologue בעכברים של חלבון סרטן התנגדות טרנספורטר שד ABC (BCRP, ABCG2), יש לפחות ארבעה מקדמים חלופיים, מיועדים על ידי אקסונים הראשון ארבעה החלופי המתאים פיק: E1U, e1a, E1B, ו E1C. בזאת, ב-סיליקון פרוטוקולים מוצגים לחזות שימוש אמרגן חלופי Bcrp1. יתר על כן, שיטות assay הכתב מתוארים לייצר מבני כתב יזמים חלופיים ולקבוע את הפונקציונליות של יזמים משוערים במעלה זרם של אקסונים הראשון החלופי מזוהים.
Introduction
יותר ממחצית גנים אנושיים מוסדרת יזמים חלופיים 1. אמרגן כל חלופה יכול להכיל אלמנטים רגולטוריים שעשויה להיות שונים מאלה הנהוגים יזמי אלטרנטיבה אחרים. האמרגן (הים) מנוצל ברקמה אחת עשוי להיות שונה מאלה המשמשים רקמה אחרת. לדוגמא, ייתכן כי הפעלת מסלול איתות נתונה עלולה לעורר את האמרגן החלופי גן מנוצל ברקמה אחת, עדיין אין כל השפעה על או להדחיק אמרגן חלופה נפרד אותו הגן כי הוא מנוצל ברקמה אחרת.
ביטוי של גן Bcrp1 נשלט על ידי יזמים חלופיים. Bcrp1 הוא orthologue בעכברים של חלבון סרטן שד התנגדות האנושי הגן (BCRP). BCRP הוא קלטת מחייב ATP (ABC) טרנספורטר, המיועד באופן רשמי ABCG2 2, 3. בתור חלבון הממברנה פסגה, BCRP / פונקציות Bcrp1 כדי בזרימת מגוון רחב של מצעים טבעיים xenobiotic <sup> 3, 4. אצל בני אדם ועכברים, BCRP / Bcrp1 מבוטא בכמות גבוהה באיברים רלוונטיים פרמקולוגית כגון כבד (אפיקים, נקבות מרות), מעי, כליות, כמו גם איברים עם מחיצות דם ברקמות כגון שליה, מוח testis 2, 5 – 12. הביטוי של BCRP / Bcrp1 ב hematopoietic בתאי גזע אחרים, כולל תאי גזע סרטניים, עשוי להקנות עמידות של תאים אלה xenobiotics ותרופות כימותרפיות סרטן 3.
בעבודה מוקדם להבין את בקרת ביטוי BCRP בתאים נורמלים ממאירים, 5 'הגברה מהירה של קצות cDNA (5'-RACE) ניתוח של mRNA BCRP בוצעה על מנת לקבוע אתר תחילת התעתיק המדויק שלה 13. לא רק היו אתרי תעתיק התחלה מרובים מצאו; גם נתקלו היו שלוש צורות חלופיות של אקסון הראשון, אשר BCRP הוא לא מתורגם. אקסונים הראשונים החלופיים אלה – המיועדים e1a, E1b, E1c – באו לידי ביטוי באופן שונה במגוון רקמות אנושיות. שתי גרסות אקסון ראשונות נוספות התגלו חיפוש יפציץ של מסד נתוני EST אדם באמצעות אקסון השני של BCRP 13. ארבעה גפרורים חשפו אקסון ראשון> 70 kb במעלה זרם אקסון 2 אשר יועדו E1u; ארבעה משחקים אחרים גילה BCRP mRNA כי חסרים אקסון ראשון כולו, אשר יועדו E1- 13. הנוכחות של אקסונים מנהיג חלופיים נחשבת ביטוי של שימוש אמרגן חלופי 14.
בעכברים, ארבעה אקסונים ראשונים חלופיים Bcrp1 מתוארים שעשויות מתאימות יזמים חלופיים השולטים שעתוק 1 BCRP ברקמות עכבר שונים; אלה אקסונים / היזמים מיועדים E1U, e1a, E1B ו E1C, והם ממוקמים כ 70, 58, 15, ו -5 קילו במעלה הזרם אקסון Bcrp1 2 5, 15. איזופורם mRNA e1a נמצא שולט Murinדואר בתאי גזע hematopoietic, לב, ריאות, טחול, ומוח, ואילו איזופורם E1B התבטא מעי עכבר, תאים בכבד עובר, ותאי מבשר erythroid ב מח עצם 5, 15. האמרגן במעלה זרם E1B הוצג להיות האמרגן החלופי החשוב מסדירי שעתוק Bcrp1 במעי עכבר, מוסדר לפחות בחלקה, על ידי חלבון מחייב אלמנט בתגובת phospho-מחזורי-AMP (p-CREB) ואלמנט בתגובת CREB ייחודי חלופי אמרגן Bcrp1 16. איזופורם mRNA E1C מתבטאת בעיקר בכבד בעכברים בוגרים כליה 5. איזופורם E1U ניתן לגילוי ברוב הרקמות שנבדקו למעט testis בעכברים, שבו הוא איזופורם השולט הביע 5. Bcrp1 לידי ביטוי האשכים חולדה נמצא בשני סומטי (צמתים הדוקים אנדותל, תאי myoid peritubular, ותאי Sertoli) ותאי נבט (ב האנדותל seminiferous, שבו הוא עשוי להגן spermatids בשלב מאוחר 4). רגיון במעלה זרם E1U מכיל מרכיב בתגובה פונקציונלי-1 גורם steroidogenic (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA וחלבונים מופחתים באופן ניכר באשכים של עכברים בנוקאאוט SF-1 תא ספציפי Sertoli, דבר המצביע על כך הביטוי Bcrp1 בתאים Sertoli murine נשלטת על ידי SF-1 5.
הפרוטוקולים שהוצגו שיטות פרט לזהות אקסונים ראשונים חלופיים Bcrp1 ב-סיליקון, ולבסס מבחני כתב מבוסס בלוציפראז עבור יזמים משוערים במעלה זרם מן אקסונים הראשונים האלטרנטיבה המזוהית.
Protocol
Representative Results
Discussion
רוב השיטות ותוצאות נציג הציגו מתוארים בעבודה קודמת תחת כותרת "שעתוק B crp1 ב testis עכבר נשלט על ידי אמרגן במעלה הזרם של אקסון הראשון רומן (E1U) מווסת על ידי גורם-1 steroidogenic," אשר פורסם בשנת 2013 5 . בנוסף לתוצאות הנציג המתוארות כאן, בעיתון הקודם ספק אומדני ניצול אקס…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרסי סקירת כשרון דאגלס ד רוס וכדי עריף חוסיין מהמחלקה לענייני יוצאי הצבא.
Materials
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep – isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
References
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis–an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer’s brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5′ untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Promega. . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System – INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. . Quick Ligation Kit Protocol – M2200S. , (2014).
- Roche. . XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol – Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. . Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
