Methoden om Ontdek Alternatieve Promoter Gebruik en transcriptionele regulatie van Murine Bcrp1
Summary
De muizen ABC transporter Bcrp1 (ABCG2) als voorbeeld, in-silico protocollen worden alternatieve promoter gebruik detecteren genen tot expressie gebracht in muizenweefsels en de functionaliteit van de alternatieve promotors geïdentificeerd onder toepassing reporter assays te evalueren.
Abstract
Genexpressie in verschillende weefsels wordt vaak gecontroleerd door alternatieve promotors die resulteren in de synthese van mRNA met unieke – meestal onvertaald – eerste exons. Bcrp1 (ABCG2), de muizen ortholoog van de ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), heeft ten minste vier alternatieve promoters die door de bijbehorende vier alternatieve eerste exons geproduceerd worden aangeduid: E1U, E1A, E1B en E1C. Hierin, in-silico protocollen worden alternatieve promoter gebruik voorspellen Bcrp1. Verder zijn reporter assay werkwijzen beschreven reporter constructen alternatieve promotors te produceren en de functionaliteit van putatieve promotors stroomopwaarts van de eerste alternatieve exons die geïdentificeerd bepalen.
Introduction
Meer dan de helft van de menselijke genen worden gereguleerd door alternatieve promoters 1. Elke alternatieve promoter kan regulerende elementen die verschillen van die in andere alternatieve promoters kunnen zijn. De promoter (s) toegepast in een weefsel kan verschillen van die welke in een ander weefsel. Zo is het mogelijk dat activatie van een bepaalde signaalweg alternatieve promotor voor een gen gebruikt in een weefsel kan veroorzaken, maar hebben geen effect op of onderdrukken een aparte alternatieve promotor voor hetzelfde gen dat wordt gebruikt in een ander weefsel.
Expressie van het Bcrp1 gen wordt beheerst door alternatieve promotors. Bcrp1 is de muizen ortholoog van het menselijk Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) gen. BCRP is een ATP-bindende cassette (ABC) transporter, formeel aangewezen ABCG2 2, 3. Als apicale plasmamembraan eiwit BCRP / Bcrp1 functies uiteenlopende natuurlijke en xenobiotische substraten uitstromen <sup> 3, 4. Bij mensen en muizen, wordt BCRP / Bcrp1 hoog tot expressie in farmacologisch relevante organen zoals lever (galcanaliculi), darm en nier, en organen met bloed-weefselbarrières zoals placenta, hersenen en testis 2, 5-12. Expressie van BCRP / Bcrp1 in hematopoietische en andere stamcellen, waaronder kanker stamcellen kunnen weerstand van deze cellen verlenen tegen xenobiotica en kanker chemotherapeutica 3.
In vroege werk de regeling van BCRP expressie in normale en neoplastische cellen te begrijpen, 5 'snelle amplificatie van cDNA-uiteinden (5'-RACE) analyse van BCRP mRNA werd uitgevoerd om de precieze transcriptionele startplaats 13 bepalen. Niet alleen waren meerdere transcriptie startplaatsen gevonden; ook ondervonden werden drie verschillende vormen van het eerste exon, die BCRP is onvertaald. Deze alternatieve eerste exons – aangewezen E1a, E1b, E1C – zijn verschillend tot expressie gebracht in diverse menselijke weefsels. Twee extra eerste exon varianten werden ontdekt in een BLAST-onderzoek van de menselijke EST-gegevensbank met het tweede exon van BCRP 13. Vier wedstrijden onthulde een eerste exon> 70 kb stroomopwaarts van exon 2 die zijn aangewezen E1u; vier andere wedstrijden bleek BCRP mRNA dat een eerste exon geheel ontbrak, die werden aangeduid N1- 13. De aanwezigheid van alternatieve exons leader wordt beschouwd als een manifestatie van alternatieve promoter gebruik 14 zijn.
Bij muizen, worden vier alternatieve eerste exons van Bcrp1 beschreven die kunnen overeenkomen met alternatieve promotors die bepalen Bcrp 1 transcriptie in verschillende muis weefsels; deze exons / promotoren zijn aangewezen E1U, E1A, E1B en E1C en zijn zich ongeveer 70, 58, 15 en 5 kb stroomopwaarts van exon 2 Bcrp1 5, 15. De E1A mRNA isovorm werd gevonden overheersende in Murin te zijne hematopoietische stamcellen, hart, long, milt en hersenen, terwijl de E1B isovorm muizendarm, foetale levercellen en erythroïde voorlopercellen werd tot expressie gebracht in beenmerg 5, 15. De promoter stroomopwaarts van E1B bleek de belangrijkste alternatieve promoter betreffende Bcrp1 transcriptie in muizendarm zijn gereguleerd althans gedeeltelijk, door fosfo-cyclisch-AMP respons element bindend eiwit (p-CREB) en een CREB responselement uniek dat alternatieve Bcrp1 promotor 16. De E1C mRNA isovorm wordt voornamelijk tot expressie gebracht in volwassen muizen lever en nieren 5. De E1U isovorm niet detecteerbaar in de meeste geteste behalve muizen testis, waar de overheersende isovorm tot expressie 5 weefsels. Bcrp1 uitgedrukt in rat testes is te vinden in zowel somatische (endotheel krappe kruispunten, peritubulaire myoid cellen en Sertoli-cellen) en kiemcellen (in de seminiferous endotheel, waar het kan beschermen laat stadium spermatiden 4). de region stroomopwaarts van E1U bevat een functionele respons element voor steroïdogene factor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA en eiwit aanzienlijk verminderd in de testes van Sertoli celspecifieke SF-1 knockout muizen, wat suggereert dat Bcrp1 expressie in muis Sertoli cellen wordt gecontroleerd door SF-1 5.
De protocollen detail gepresenteerd methoden alternatieve eerste exons van Bcrp1 detecteren in-silico, en luciferase-gebaseerde reporter assays voor putatieve promotors vast stroomopwaarts van de eerste alternatieve exons geïdentificeerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meeste van de methoden en representatieve resultaten die zijn beschreven in eerdere werk getiteld "B CRP1 transcriptie in muizen testis wordt gecontroleerd door een promoter stroomopwaarts van een nieuwe eerste exon (E1U) gereguleerd door steroïdogene factor-1 ', die in 2013 5 gepubliceerd . Naast de representatieve resultaten hier weergegeven, de vorige Stortbak voor schattingen van alternatieve eerste exon gebruik middels 5'-RACE PCR en RT-PCR methode. Verder in-silico ide…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Merit Beoordeling Awards Douglas D. Ross en Arif Hussain van het Department of Veterans 'Affairs.
Materials
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep – isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
References
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis–an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer’s brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5′ untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Promega. . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System – INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. . Quick Ligation Kit Protocol – M2200S. , (2014).
- Roche. . XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol – Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. . Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
