糖鎖ノード分析：グライコミクスへのボトムアップアプローチ

Summary

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

Abstract

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides (“glycan nodes”) present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

Introduction

糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、及びグリコサミノグリカンをまとめグリカンとして知られている複雑な、異種の炭水化物の4つの主要なクラスを構成しています。原形質膜、糖衣、細胞外マトリックス及び体液のようなユビキタス及び積分成分、グリカンは、エンドサイトーシス、細胞内輸送、細胞運動性、シグナル伝達、分子認識、受容体活性化、細胞接着、宿主 – 病原体相互作用のような多様な生化学的プロセスに参加、細胞間コミュニケーション、免疫学、および免疫応答の開始。生活のほぼすべてのドメイン内の¹本は、グリカンポリマーを構築するグリコシルトランスフェラーゼとして知られている酵素は、改造を構築するために（もグリカンを分解するグリコシダーゼ、として知られている）グリコシドヒドロラーゼと連携して行動しますそして最終的に確定グリカンポリマー^2を生成^します 。各糖転移酵素は、異なる複合糖質の糖転移酵素を操作することができるが、一般的求核アクセプターの特定のカテゴリ（ 例えば、脂質、ポリペプチド、核酸、または成長に特定の活性化されたヌクレオチド糖供与体（ 例えば、GDP-フコース）の単糖類部分を転送することによってlinkage-とアノマー固有のグリコシド結合を偽造オリゴ糖）。タンパク質の50％以上（特に膜および分泌タンパク質）は、翻訳後グリコシル化によって修飾されていると推定されている³初歩的な組み合わせの計算がグリコシル化によって糖タンパク質に従うかなりのばらつき、汎用性、および特異性についての評価を提供します。例えば、ポリペプチド基質は、わずか10グリコシル化部位を持っている場合、それぞれのサイトには、還元末端のみ3つの異なる単糖の1でグリコシド結合を形成することができ、その後、理論的には、最終的な糖タンパク質は、3 ¹⁰ = 59049明確なアイデンティティをとることができます。糖タンパク質では、グリコシド結合は、一般的に、側鎖の窒素Oで形成します配列Asn-X-Ser / Thr中のFのアスパラギン残基（Xはプロリンを除く任意のアミノ酸であり得る）Oの -glycans ^4を得N -glycans ²及びセリン及びスレオニン残基の側鎖ヒドロキシルを得ました。いくつかの例外を除いて、グリコシルトランスフェラーゼには厳格なドナー、アクセプター、およびリンケージ特異性を示す、ため、細胞のグライコーム（ すなわち、グリコシル化製品のその相補）の組成は、ユニークで制限されています^。5重要と豊富な血漿糖タンパク質は、下流の結果として異常なグリコシル化を被ります多くの病理学的状態に起因する異常な糖転移酵素の発現および活性、特に癌および炎症性疾患^。6月24日の

主にエピジェネティックな要因に起因して、グライコームは、哺乳動物ゲノムの約1％が形成、変更をコード化しながら。かなり^25,26プロテオームとトランスクリプトームよりも、多様でダイナミック、かつ複雑であり、グリカンのアセンブリは、非テンプレート駆動型の方法でマークされた対照的に²⁷のグリコシル化が進行は、ポリペプチドおよび核酸生合成します。グリコシル化酵素や栄養素や前駆体可用性などの環境要因の相対的な量と活動の間の相互作用は、最終的にグリコシル化の性質、速度、および程度を決定する^。5,28胚（ 例えば、決意と分化）、細胞活性化、および進行を通して細胞周期に影響を与える遺伝子発現（ すなわち、転写および翻訳）とは、その活性が、細胞のグリカンプロファイルのすぐ上流の決定要因である利用可能なグリコシルトランスフェラーゼの正体と量を変えます。 （の一部）は、増殖、接着剤、および癌細胞の浸潤特性は、通常の胚形成細胞のもの、グリカン生合成経路の特定の変化（ 例えば、前駆体の蓄積、調節解除された表現、aberranに似ているので。トンの変更、構造切り捨て、または新規の形成が）ユニバーサル癌腫瘍形成の様々な段階を示すバイオマーカー、進行、遊走、および浸潤として働く²⁹グリコシル化は非常に複雑であるが、明らかにグリコシル化における唯一の少数の変化は、発癌および転移を有効にすることができます。どう ​​やら、特定の「異常な」グリコシル化製品が実際に免疫認識を回避し、無愛想な血管内および転移性環境での移行の要求を生き残るためにそれらを可能にすることによって、癌細胞に利益をもたらす^。28,30,31驚くことではないが、実験では、変更されたのパターンを中断または予防することを明らかにしました遺伝子発現および異常なグリカン形成はそれにもかかわらず^。29腫瘍形成を停止させることができ、生体液試料（ 例えば、尿、唾液、および血漿または血清）で検出された異常なグリカンは、癌（または別の疾患）の直接的な指標ではないかもしれないが、むしろ下流微妙なまだ重要なの成果免疫系または予測不可能な器官における悪性状態の定量化可能な波及効果の変化^。32

彼らはグライコームについて、汎用的に提供するが、多くの分子間相互作用ベースのグライコミクス技術（ 例えば、レクチン/抗体アレイおよび代謝/共有結合標識）は、全グリカン構造の検出に依存し、個々のグリカンについての詳細な構造情報を提供していません。著しく対照的に、質量分析（MS）は、個々のグリカン構造を同定し、定量化することができ、そしてポリペプチドのコアへの結合部位のような構造情報を明らかにする。唯一の糖転移酵素の調節解除された発現または活性は、複数のグリコシル化経路における有害な分子事象のカスケードを開始することができます。各糖転移酵素が複数の複合糖質基板上に、異なる成長グリカンポリマー全体に動作することができるので、調節解除された生合成カスケードがdisproporをもたらします一つだけグリカン製品のtionally増加量が、細胞内又は細胞外液中の異常なグリカンのいくつかの不均質なクラス^。33大きなプールに比べて、しかし、このようなユニークな異常なグリカンは、時々 、癌または他のグリカン-感情の病状のためのバイオマーカーとして実用的でないと考えられていますよく調整されたグリカン、これらの異常なグリカンは、多くの場合であっても、質量分析などの高感度技術では検出できないままであってもよい非常に小さな割合を表します。例えば、細胞内および細胞外体液中の、（大きさの8オーダーに及ぶ）幅広いタンパク質濃度スペクトルは、より豊富な種によってマスクされる希少糖タンパク質の検出を防止することができる。 ^図32はまた、グリコシルトランスフェラーゼ活性を決定することは実用的でかなりのままそして多くの糖転移酵素は、臨床生体液中に存在しないか、またはex vivoで非アクティブになっているので、理論上の課題。 consistenの難しさにもかかわらず、TLYユニークな全体グリカンの超微量を検出および定量、質量分析の実践者は、臨床マーカーとしてそのままグリカンを採用に向けて多大な進歩を遂げてきました。我々は最近、一緒に各グリカンに一意性を付与するすべての構成要素の分岐点とリンケージ固有の単糖類（「グリカンノード」）の検出を容易にし、多くのでは、GC-MSを用いて、無傷のグリカンの分析に相補的なアプローチを開発しました例は、直接過失糖転移酵素（複数可）の相対活性を定量化する分子代理としての役割を果たす。

その第一は、1958年グリカン分析への直接適用を報告しているので、ガスクロマトグラフィー（GC）は^、34単位のメチル化単糖および二糖の分析それらのアノマーと絶対配置を決定し、その後の質量分析のためにそれらを分離するための強力な技術であることが証明された^。35 1984年と2007年、Ciucanuや同僚の間で導入し、水とクロロホルムを使用して、過メチル化グリカンの液/液抽出し、水酸化ナトリウムおよびヨードメタンを用い、固相グリカン過メチル化技術を、洗練された。2005年から2008年の間に^35,36、カンと共同研究者は、時間節約のスピンを統合しました過メチル化のステップへ-カラムのアプローチ。2008年には^37,38は 、ゲッツの研究グループは、比較し、潜在的に侵襲的および非区別するために、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）質量分析法を用いた糖鎖プロファイリング法過メチル化定量的な固相を考案しましたその後、2009年に、ゲッツチームを合わせ、酵素および化学リリース技術が高度にアルカリ性の固相過メチル化方式で、無傷の糖タンパク質からO -glycansを切断する^{39 40}ゲッツ手続きが同時過メチル化や化学物質放出を促進しているが、-invasive乳癌細胞。 Oの -glycansの、それだけ予め絶縁糖に適用されましたタンパク質。私たちは2013年にこの技術を修正し、トリフルオロ酢酸（TFA）加水分解、還元、アセチル化手順を組み込むことによって、全体の未分画生体液と均質化した組織サンプルのためにそれを適応さ^。33これらの追加の手順はまた、糖脂質からグリカンを放出し、Nは、糖タンパク質および変換からグリカンを-結合しました特徴的なメチル化およびアセチル化パターンを一意的にGC-MSにより分析を容易に元の完全なグリカンポリマー^41（ 図2）で構成グリカンノードを特徴付ける部分メチル化アルジトールアセテート（PMAAs、 図1）に彼ら^。33最終的に、この手順は、「コアのフコシル化」、「6 – シアル化」、「バイセクティングGlcNAc」、および「ベータ1-6分岐」などユニークなグリカンの機能を直接、相対的な定量化に基づく複雑な生体液中のすべてのグリカンの複合肖像画を生成します – 各単一GC-MSのchromatograp由来HICピーク。この記事では、相対定量のモードの改善に伴って、さらに過メチル化の最適化、アセチル化、分離、およびクリーンアップの段階を示しています。

Protocol

注意：この実験で使用される試薬のいずれかと皮膚/眼への接触を避けること。曝露の際に、水で十分に洗い流し、直ちに医師の診察を受けます。 1.完全メチル化およびグリカンの抽出 カラム調製 サンプルを分析するためにできるだけ多くの微量遠心スピンカラムユニットを得ます。ブレイクとプラスチック収容管のキャップを外します。各収容…

Representative Results

相対的な2つの重要な過メチル化のステップが正しく実行された場合に成功した過メチル化、加水分解、還元、およびヒト血漿サンプルのアセチル化を示す全イオン電流クロマトグラム（TIC）は、 図3に示されています。 ヘキソースへのHexNAcの相対の絶対収量 ： <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa…

Discussion

一般的には、ヘキソースから部分的にメチル化アルジトールアセテート（PMAAs）の成功した生産が少ないの困難をはらんでいるとN -acetylhexosamine（のHexNAc）PMAAsの成功の生産よりも堅牢です。それは、この手順のすべての段階で演じているように、この現象の背後にある正確なメカニズムは不明であるが、ヘキソースへのHexNAcの相対的に一意である（という水酸基以外）N -アセチ?…

Materials

Sodium hydroxide beads	367176	Sigma-Aldrich	20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 mL Spin column	69705	Pierce division of ThermoFisher Scientific	Includes  plugs and polyethylene frits
GC-MS autosampler vial (silanized)*	C4000-9	ThermoFisher Scientific	Target DP High Recovery Vial, 1.5 mL, 12 x 32 mm, Includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 mL polypropylene test tubes	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
2 mL polypropylene test tubes	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane	I8507	Sigma-Aldrich	Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Microcentrifuge	75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)*	53283-800	VWR	13 x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride	S7653	Sigma-Aldrich	>99.5% pure
Chloroform	4440-08	Macron Fine Chemicals
Trifluoroacetic acid	299537	Sigma-Aldrich	99% purified by redistillation for protein sequencing
Sodium borohydride	71321	Fluka Analytical	99%
Ammonium hydroxide solution	320145	Sigma-Aldrich	NH3 content: 28.0 – 30.0%
Methanol	AH230-4	Honeywell Burdick & Jackson	HPLC grade
Acetic acid	320099	Sigma-Aldrich	99.70%
Plastic vacuum desiccator	Any model of adequate size	FoodSaver
Acetic anhydride	539996	Sigma-Aldrich	99.50%
Dichloromethane	D143SK-4	ThermoFisher Scientific	Stabilized HPLC grade
Acetone	9006-03	J.T.Baker	Baker Analyzed
Heated evaporation manifold (main unit)	pi18823	ThermoFisher Scientific	Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator)	pi18826	ThermoFisher Scientific	ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold	pi18816	ThermoFisher Scientific	Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13mm dia test tubes, 13 holes (14 dia. x 45mm deep)
Gas chromatograph	Model A7890	Agilent	Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer	GCT Premier (Time-of-Flight)	Waters
Split-mode liner (deactivated / silanized)	5183-4647	Agilent	Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column	122-5532	Agilent	30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane	95541	Sigma-Aldrich
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization)	EW-06536-30	Cole-Parmer	12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.