Glycan Knoten Analyse: Ein Bottom-up-Ansatz Glycomics

Summary

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

Abstract

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides (“glycan nodes”) present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

Introduction

Glycolipide, Glycoproteine, Proteoglycane und Glycosaminoglycane bilden die vier Hauptklassen von komplexen, heterogenen Kohlenhydrate als Glykane gemeinsam bekannt. So allgegenwärtig und integrale Bestandteile der Plasmamembran, Glykokalyx, und die extrazelluläre Matrix und Flüssigkeiten, teilzuhaben Glycane in so unterschiedlichen biochemischen Prozesse wie Endozytose intrazellulär Handel, Zellmotilität, Signaltransduktion, molekularen Erkennung, Rezeptoraktivierung, Zelladhäsion, Wechselwirkung Wirt-Pathogen , die interzelluläre Kommunikation, immunosurveillance und Immunantwort Initiation. ¹ Präsent in fast jeder Domäne des Lebens, wie Glycosyltransferasen bekannte Enzyme , die Glykan Polymere wirken im Tandem bauen mit Glycosidhydrolasen (auch als Glycosidasen bekannt, die Glykane brechen) zu konstruieren, gestalten, und schließlich produzieren abgeschlossen Glykan Polymere ^2. Obwohl jeder Glycosyltransferase auf verschiedenen Glycokonjugaten arbeiten kann, eine Glycosyltransferaseallgemein schmiedet eine linkage- und Anomer-spezifischen glykosidischen Bindung durch die Monosaccharid – Einheit eines bestimmten aktivierten Nucleotidzucker Donator übertragen (beispielsweise GDP-Fucose) zu einer bestimmten Kategorie von nucleophilen Akzeptoren (beispielsweise ein Lipid, Polypeptid, eine Nukleinsäure, oder wachsende Oligosaccharid). Es wurde geschätzt , dass mehr als 50% der Proteine ​​(insbesondere Membran und sekretorischen Proteinen) sind post-translational durch Glykosylierung modifiziert ³ Rudimentäre kombinatorischen Berechnungen eine Anerkennung für die große Variabilität bieten, Vielseitigkeit und Spezifität an Glykoproteine ​​durch Glykosylierung gewährt. Wenn ein Polypeptid Substrat 10 Glykosylierungsstellen zum Beispiel, hat , und jede Seite kann mit 1 von nur 3 verschiedene Monosaccharid des reduzierenden Enden, dann theoretisch die endgültige Glykoprotein kann 3 ¹⁰ = 59.049 verschiedene Identitäten annehmen eine glycosidische Bindung bilden. In Glykoproteine ​​bilden Glykosidbindungen gemeinsam mit der Seitenketten-Stickstoff of Asparaginresten in der Sequenz Asn-X-Ser / Thr (X ist eine beliebige Aminosäure außer Prolin sein kann) N zu ergeben Glycane ² und Seitenketten – Hydroxylgruppen von Serin und Threonin – Resten O ⁴ – Glycane zu ergeben. Die Zusammensetzung einer glycome der Zelle (dh sein Komplement von Glykosylierungsprodukte) ist einzigartig und begrenzt , da mit wenigen Ausnahmen, Glycosyltransferasen strenge Spender zeigen, Akzeptor und Verknüpfung Spezifität. ⁵ Wichtige und reichlich Blutplasma Glykoproteine ​​anomale Glykosylierung als nachgeschalteter Folge leiden viele pathologische Zustände abnormer Glycosyltransferase Expression und Aktivität aufgrund, insbesondere Krebs und entzündlichen Erkrankungen. ^6-24

Vor allem aufgrund der epigenetischen Faktoren ist die glycome wesentlich vielfältiger, dynamischer und komplexer als das Proteom und Transkriptom. ^25,26 Während etwa 1% des Säugetiergenoms , die Bildung, Modifikation kodiert, undMontage von Glycanen, ²⁷ Glykosylierung erfolgt in einem nicht-template risch-ein deutlichem Gegensatz zu Polypeptid und Nukleinsäure – Biosynthese. Das Zusammenspiel zwischen der relativen Menge und Aktivität der Glycosylierungsenzyme und solche Umweltfaktoren als Nährstoff und Vorläufer Verfügbarkeit bestimmt letztendlich die Art, die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Glykosylierung. ^5,28 Embryonalentwicklung (zB Bestimmung und Differenzierung), Zellaktivierung, und die Progression durch der Zellzyklus Einfluss Genexpression (dh Transkription und Translation) und die Identität und die Menge der verfügbaren Glycosyltransferasen ändern, deren Tätigkeit die unmittelbare stromauf Determinante des Glycans Profil der Zelle. Weil (einige) die proliferative, Klebstoff und invasive Eigenschaften von Krebszellen ähneln denen der gewöhnlichen embryogenen Zellen, spezifische Änderungen in Glykan Biosynthesewege (zB Vorläufer Akkumulation, deregulierten Expression aberrant Modifikation, strukturelle Abschneiden oder neuartige Bildung) dienen als universelle Krebs Biomarker , die verschiedenen Stadien der Tumorbildung zeigen, Progression, Migration und Invasion ²⁹ Obwohl Glykosylierung sehr komplex ist, offenbar nur wenige Änderungen in der Glykosylierung der Karzinogenese und Metastasierung ermöglichen kann. offenbar gewisse "anomale" Glykosylierungsprodukte tatsächlich Krebszellen profitieren , indem ihnen die Immunerkennung zu entziehen und die Anforderungen der Migration in unwirtlichen intravaskulären und metastatischen Umgebungen überleben. ^28,30,31 nicht überraschend, haben Versuche gezeigt , dass zu stören oder zu verhindern Muster verändert Genexpression und anomale Glykan Bildung kann tumorigenesis stoppen. ²⁹ Dennoch sind die anomalen in einer Biofluid Probe nachgewiesen Glykane (zB Urin, Speichel und Blutplasma oder Serum) kann nicht sein , direkte Indikatoren für Krebs (oder eine andere Krankheit), sondern stromabwärts Ergebnisse der subtilen, aber signifikantVeränderungen im Immunsystem oder quantifizierbaren Auswirkungen eines schädlichen Zustand in einem unberechenbaren Organ. ³²

Obwohl sie universal Informationen über die glycome viele molekulare Wechselwirkung basierenden glycomics Techniken (beispielsweise Lectin / Antikörper – Arrays und metabolische / kovalente Markierung) liefern , hängen von der Erkennung von ganzen Glykanstrukturen und liefern keine detaillierte Strukturinformationen zu den einzelnen Glykane. In deutlichem Gegensatz dazu kann der Massenspektrometrie (MS) identifizieren und individuelle Glykanstrukturen quantifizieren und solche strukturellen Informationen wie die Befestigungsstellen an Polypeptid Kerne aufzudecken. Deregulierten Expression oder Aktivität von nur einer Glycosyltransferase kann eine Kaskade von schädlichen molekularen Vorgänge in mehreren Glycosylierungswege initiieren. Da jeder Glycosyltransferase auf mehr als einem Glykokonjugat Substrat und in den verschiedenen wachsenden Glykan Polymere, dereguliert Biosyntheseketten ergeben dispropor arbeiten kanntional erhöhte Mengen von ³³ jedoch nur ein Glykan Produkt , sondern mehrere heterogene Klassen von anomalen Glykane in intra- oder extrazellulären Flüssigkeiten., so einzigartig anomale Glykane manchmal gelten als unpraktisch als Biomarker für Krebs oder andere Glykan-affektiven Erkrankungen , da im Vergleich zu den großen Pool von gut regulierten Glykane, diese anomale Glykane nur ein sehr geringer Anteil, der kann oft nicht nachweisbar bleiben, auch durch solche hochempfindliche Techniken wie Massenspektrometrie. Beispielsweise in intra- und extrazellulären Körperflüssigkeiten, die breite Proteinkonzentrations – Spektrum (die acht Grßenordnungen umspannt) können Detektions knapper Glycoproteine ​​zu verhindern , die durch die reichlicher Spezies maskiert sind. ³² Außerdem Glycosyltransferaseaktivität Bestimmung bleibt ein erheblicher praktischer und theoretische Herausforderung , weil viele Glycosyltransferasen fehlen in der klinischen biofluids oder inaktiv ex vivo. Trotz der Schwierigkeit, consistently Erfassung und extrem winzigen Mengen von einzigartigen Ganzen Glykane zu quantifizieren, Praktiker der Massenspektrometrie haben enorme Fortschritte in Richtung auf den Einsatz intakter Glykane als klinischer Marker gemacht. Wir haben vor kurzem einen komplementären Ansatz zur Analyse von intakten Glykane entwickelt, die GC-MS verwendet wird, die Erfassung aller konstituierenden Verzweigungspunkt und bindungsspezifischer Monosaccharide ( "Glykan Knoten"), die zusammen verleihen Einzigartigkeit jedes Glykan und in vielen erleichtert Fälle direkt als molekulare Surrogate dienen, die die relative Aktivität des schuldhaftem Glycosyltransferase (n) zu quantifizieren.

Seit seiner ersten 1958 die direkte Anwendung auf Glykananalyse berichtet, Gaschromatographie (GC) ist eine leistungsfähige Technik erwiesen per-methyliert Mono- und Disacchariden ³⁴ zu analysieren, bestimmen ihre anomericity und absolute Konfiguration und sie für die nachfolgende massenspektrometrische Analyse trennen. ³⁵ zwischen 1984 und 2007, Ciucanu und Kollegeneine Festphasen – Glycan Permethylierung Technik eingeführt und verfeinert , die Natriumhydroxid und Iodmethan verwendet wird , durch Flüssig / Flüssig – Extraktion von permethyliertem Glykane mit Wasser und Chloroform. ^35,36 Zwischen 2005 und 2008, Kang und Mitarbeiter integriert , um eine zeitsparende Spin -column Ansatz in den Permethylierung Schritt. ^37,38 im Jahr 2008 erarbeitete die Goetz Forschungsgruppe eine quantitative Festphasen – Permethylierung Glykan-Profilierungsverfahren unter Verwendung von Matrix-assistierte Laser – Desorptions-Ionisations (MALDI) Massenspektrometrie zu vergleichen und möglicherweise unterscheiden invasive und nicht -invasive Brustkrebszellen; ³⁹ dann, im Jahr 2009, die Goetz Team kombiniert enzymatische und chemische Release – Techniken zu spalten O – Glycane aus intakten Glykoproteinen in einer stark alkalischen Festphasen Permethylierung Schema ⁴⁰ Obwohl die Goetz Verfahren gleichzeitige Permethylierung und chemischen Freisetzung erleichtert. O – Glycane, wurde es nur auf vorisolierten Glyco angewendetProteinen. Wir diese Technik im Jahr 2013 modifiziert und angepasst für ganze unfraktioniertem Biofluiden und homogenisiert Gewebeproben von Trifluoressigsäure enthält (TFA) Hydrolyse, Reduktion und Acetylierung Schritte. ³³ Diese zusätzlichen Schritte auch Glykane aus Glycolipiden und N lösen -verknüpfte Glykane aus Glykoproteinen und wandeln sie in teilweise methylierte Alditolacetate (PMAAs, Abbildung 1), dessen Unterscheidungs ​​Methylierungs-and-Acetylierung Muster erleichtern die Analyse durch GC-MS und zu charakterisieren , in einzigartiger Weise die konstituierenden Glykan Knoten in der ursprünglichen intakten Glykan Polymer ⁴¹ (Abbildung 2). ³³ letztlich diese Verfahren erzeugt ein zusammengesetztes Porträt aller Glykane in einem komplexen Biofluid basierend auf direkte, relative Quantifizierung von einzigartigen Glykan Funktionen wie "Kern Fukosylierung", "6-Sialylierung", "bisecting GlcNAc" und "beta 1-6 Verzweigung" – jeweils von einem einzigen GC-MS chromatographic Spitze. Dieser Artikel stellt eine weitere Optimierung der Permethylierung, Acetylierung, Isolation und Clean-up-Phasen zusammen mit Verbesserungen in der Art der relativen Quantifizierung.

Protocol

Vorsicht: Vermeiden Sie Haut / Augenkontakt mit einem der Reagenzien , die in diesem Experiment verwendet. Bei der Belichtung spülen gründlich den betroffenen Bereich mit Wasser und suchen Sie sofort einen Arzt auf. 1. Permethylierung und Glycan Extraction Säulenvorbereitung Erhalten, wie viele Mikrofuge spin column Einheiten als die zu analysierenden Proben. Pause und nehmen Sie die Plastikbehälter Rohrkappen. Legen Sie ein Mikrofuge Mini-Filter in jedem…

Representative Results

Ein Gesamtionenstrom – Chromatogramm (TIC) zeigt erfolgreiche Permethylierung, Hydrolyse, Reduktion und Acetylierung von menschlichem Blutplasma – Proben in Bezug auf Fälle , in denen zwei kritische Permethylierung Schritte falsch ausgeführt wurden , sind in Abbildung 3 dargestellt. Absolute Ausbeute an HexNAcs Bezogen auf Hexosen: N<…

Discussion

Im Allgemeinen ist die erfolgreiche Herstellung von partiell methylierten Alditolacetate (PMAAs) von Hexosen behaftet mit weniger Schwierigkeiten und ist robuster als die erfolgreiche Produktion von N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Der genaue Mechanismus hinter diesem Phänomen , wie es in jedem Schritt dieses Verfahrens abspielt ist unbekannt, aber die einzigartige Chemie der N – acetyl – Gruppe beziehen muss ( und nicht Hydroxylgruppe), die Hexosen zu HexNAcs relativ einzigartig ist. Der Mechanism…

Materials

Sodium hydroxide beads	367176	Sigma-Aldrich	20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 mL Spin column	69705	Pierce division of ThermoFisher Scientific	Includes  plugs and polyethylene frits
GC-MS autosampler vial (silanized)*	C4000-9	ThermoFisher Scientific	Target DP High Recovery Vial, 1.5 mL, 12 x 32 mm, Includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 mL polypropylene test tubes	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
2 mL polypropylene test tubes	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane	I8507	Sigma-Aldrich	Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Microcentrifuge	75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)*	53283-800	VWR	13 x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride	S7653	Sigma-Aldrich	>99.5% pure
Chloroform	4440-08	Macron Fine Chemicals
Trifluoroacetic acid	299537	Sigma-Aldrich	99% purified by redistillation for protein sequencing
Sodium borohydride	71321	Fluka Analytical	99%
Ammonium hydroxide solution	320145	Sigma-Aldrich	NH3 content: 28.0 – 30.0%
Methanol	AH230-4	Honeywell Burdick & Jackson	HPLC grade
Acetic acid	320099	Sigma-Aldrich	99.70%
Plastic vacuum desiccator	Any model of adequate size	FoodSaver
Acetic anhydride	539996	Sigma-Aldrich	99.50%
Dichloromethane	D143SK-4	ThermoFisher Scientific	Stabilized HPLC grade
Acetone	9006-03	J.T.Baker	Baker Analyzed
Heated evaporation manifold (main unit)	pi18823	ThermoFisher Scientific	Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator)	pi18826	ThermoFisher Scientific	ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold	pi18816	ThermoFisher Scientific	Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13mm dia test tubes, 13 holes (14 dia. x 45mm deep)
Gas chromatograph	Model A7890	Agilent	Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer	GCT Premier (Time-of-Flight)	Waters
Split-mode liner (deactivated / silanized)	5183-4647	Agilent	Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column	122-5532	Agilent	30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane	95541	Sigma-Aldrich
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization)	EW-06536-30	Cole-Parmer	12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.