This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.
Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides (“glycan nodes”) present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.
당지질, 당 단백질, 프로테오글리칸과 글리코 사 미노 글리 칸 일괄 글리 칸으로 알려진 복잡한 이기종 탄수화물의 네 가지 주요 클래스를 구성한다. 마찬가지로 세포막, 글리코 칼 릭스, 세포 외 매트릭스와 유체 유비쿼터스 적분 성분, 글리 칸은 세포 내 이입 세포 내 피킹, 세포 운동성, 신호 전달 분자 인식, 수용체 활성화, 세포 부착, 호스트 병원체 상호 작용 등의 다양한 생화학 적 과정에 참여 삶의 거의 모든 영역에서 세포 간 통신, immunosurveillance 및 면역 반응 개시. 1 현재는, 글리 칸 폴리머를 구축 글리코 실 트랜스퍼 라 아제로 알려진 효소 글리코 시드 구축 (글리 칸을 무너 뜨리는 또한 글리코시다 아제로 알려진) 가수 분해, 개조와 협력하여 행동 궁극적 글리 칸 폴리머 2 최종 생산하고 있습니다. 각 글 라이코 실 트랜스퍼 라제는 다른 복합 당질에서 작동 할 수 있지만하는 글 라이코 실 트랜스퍼 라제일반적 핵성 수용체의 특정 카테고리 (예를 들어, 지질, 폴리펩티드, 핵산, 또는 성장에 특히 활성 뉴클레오티드 당 공여체 (예, GDP 푸 코스)의 단당 잔기를 전송하여 linkage-과 아노 머 특정 글리코 시드 결합을 위조 올리고당). 단백질 (특히 막과 분비 단백질)의 50 % 이상이-병진 후 당화에 의해 수정 된 것으로 추정 된 3 초보 조합 계산이 당화에 의해 당 단백질에게 부여 상당한 변화, 다양성과 특이성에 대한 감사를 제공합니다.; 폴리펩티드 기판 10 글리코 실화 부위를 가지고 있으며, 각 사이트는 단지 3 개의 단당류 환원 말단 1 글리코 시드 결합을 형성 할 경우, 예를 들어, 이론적 최종 당단백 3 10 = 59049 고유 ID를 가정 할 수있다. 당 단백질, 글리코 시드 결합은 일반적으로 측쇄 질소 O를 형성시퀀스에서 Asn-X-빼앗아에서 F 아스파라긴 잔기 /의 Thr N이 O 4 -glycans 수득 세린 및 트레오닌 잔기의 2 측쇄 수산기를 -glycans 수득하는 (X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 일 수있다). 거의 예외없이, 글리코 엄격한 도너, 억 셉터, 및 결합 특이성을 나타내는 때문에 셀의 glycome의 조성 (즉, 당화 제품의 보수)은 고유 제한된다. 5 중요 풍부한 혈장 당 단백질은 하류 결과로서 비정상적인 당화 고통 이상 글 라이코 실 트랜스퍼 라제의 발현과 활동으로 인해 다수의 병리 적 상태로, 특히 암과 염증성 질환이다. 6-24
주로 후생 유전 학적 요인 탓으로 glycome는 포유류의 게놈의 약 1 %가 형성, 수정을 인코딩하는 동안. 크게 25, 26 프로테옴 및 사체보다 더 다양한 동적, 복잡하고,글리 칸의 조립체는 비 구동 방식 템플릿 – 현저한 콘트라스트 27 당화 진행 폴리펩티드 및 핵산 생합성한다. 당화 효소 및 영양소 및 전구체 가용성과 같은 환경 적 요인의 상대적인 양 및 활성 사이의 상호 작용은 궁극적으로 포도당의 특성상, 속도 및 정도를 결정한다. 5,28 배아 (예를 들어, 판정 및 분화) 세포 활성화 및 진행을 세포주기에 영향을 미치는 유전자 발현 (즉, 전사 및 번역) 및 그 활성 세포의 글리 칸 프로파일의 바로 상류 인 결정 가능한 글리코의 동일성과 양을 변경. (의 일부) 증식하기 때문에, 접착제 및 암 세포의 침략적 속성은 일반 배아 세포, 글리 칸 생합성 경로 (예를 들면, 전구체 축적, 규제 완화 표현, aberran의 특정 변화들과 유사. t 수정, 구조 절단, 또는 소설 형성) 글리코 실화는 분명히 당화에 몇 변경이 발암과 전이를 활성화 할 수 있습니다, 매우 복잡하지만 종양 형성, 진행, 마이그레이션 및 침략 (29)의 다양한 단계를 나타내는 등의 보편적 인 암 바이오 마커를 제공; 분명히, 특정 "비정상적인"글리코 실화 제품이 실제로 면역 인식을 회피하고 험한 혈관 및 전이성 환경에서 마이그레이션의 요구를 생존 할 수 있도록함으로써 암 세포를 혜택을 누릴 수 있습니다. 28,30,31 당연히 실험 변경의 패턴을 방해하거나 방지하는 것이 밝혀졌다 유전자 발현 및 비정상적인 글리 칸 형성은 종양을 중지 할 수 있습니다. (29) 그럼에도 불구하고 biofluid 샘플 (예를 들어, 소변, 타액 및 혈장 또는 혈청)에서 검출 된 비정상적인 글리 칸은 직접 암의 지표 (또는 다른 질병), 오히려 하류하지 않을 수 있습니다 미묘하지만 중요한의 결과면역 시스템 또는 예측 기관의 악성 상태의 정량화 파급 효과의 변화. (32)
그들은 glycome 대한 범용 정보 많은 분자 상호 작용을 기반 글라 이코믹스 기술 (예를 들면, 렉틴 / 항체 어레이 및 대사 / 공유 라벨)를 제공하지만 전체 글리 칸 구조의 검출에 의존 개별 글리 칸에 대한 상세한 구조 정보를 제공하지 않는다. 현저하게 대조적으로, 질량 분석기 (MS)를 식별하고 각각의 글리 칸 구조를 정량화 폴리펩티드 코어의 결합 부위와 같은 구조적 정보를 노출 할 수있다. 규제 완화 식 또는 하나의 글 라이코 실 트랜스퍼 라제의 활동은 여러 당화 경로에 해로운 분자 사건의 폭포를 시작할 수 있습니다. 각 전이 효소가 하나 이상의 glycoconjugate 기판 상에 상이한 성장 글리 칸 중합체에서 작동 할 수 있기 때문에, 규제 완화 생합성 캐스케이드는 dispropor을 수득레이 터는 단 하나의 글리 칸 제품의 양하지만 인트라 또는 세포 외 체액의 비정상적 글리 칸의 여러 이기종 클래스 증가했다. (33) 그러나, 고유의 비정상적인 글리 칸은 때때로 암 또는 때문에 다른 글리 칸 – 정서적 병리에 대한 바이오 마커로 실용적 고려, 대형 수영장에 비해 의 글리 칸을 잘 조절이 비정상적 글리 칸은 수도가 자주도 질량 분석과 같은 매우 민감한 기술에 의해 탐지 남아 매우 작은 부분을 나타냅니다. 예를 들어, 인트라 – 및 세포 외 체액 (크기 여덟 주문 걸쳐) 광범위한 단백질 농도 스펙트럼은 더욱 풍부한 종에 의해 마스크된다 희소 당 단백질의 검출을 방지 할 수있다. (32) 또한, 당 전이 효소의 활성을 측정하는 것이 실용적 상당한 유지 많은 글리코 실 트랜스퍼 라 아제 임상 biofluids에 결석 또는 생체 전 비활성 상태이기 때문에 이론적 도전. consisten의 어려움에도 불구하고TLY 감지하고 독특한 전체 글리 칸의 울트라 분 수량을 정량화, 질량 분석의 실무자는 임상 마커로 그대로 글리 칸을 사용으로 엄청난 진보를 만들었습니다. 최근 GC-MS를 이용 함께 각 당쇄에 많은 고유성 부여 모든 구성 분 지점과 결합 특이 단당류 ( "당쇄 노드")의 검출을 용이하게 그대로 글리 칸의 분석에 상보적인 방법을 개발 경우는 직접 과실 글 라이코 실 트랜스퍼 라제 (들)의 상대 활성을 정량화 분자 대리를 제공합니다.
첫 번째는 1958 년에 글리 칸 분석에 직접 응용 프로그램을보고 있기 때문에, 가스 크로마토 그래피 (GC)는 34 당 메틸화 모노와 이당류를 분석 자신의 anomericity 절대 구성을 결정하고, 이후의 질량 분석 분석을 분리하는 강력한 기술을 입증했다. (35) 1984 년과 2007 년, Ciucanu와 동료 사이도입 된 2005 년과 2008 년 사이에 물과 클로로포름. (35, 36)를 이용하여 메틸화 글리 칸의 액체 / 액체 추출하여 수산화 나트륨 및 아이오도 메탄을 사용 고상 글리 칸과 메틸화 기술, 정제, 강 및 동료는 시간을 절약 스핀 통합 메틸화 단계에 칼 럼 접근. 2008 년 37, 38는 게츠의 연구 그룹은 비교하고 잠재적으로 침습적 및 비 구별하는 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI) 질량 분석기를 사용하여 글리 칸 프로파일 링 방법과 메틸화 정량적 인 고체상을 고안 -invasive 유방암 세포 39는, 2009 년 게츠 팀 합성 효소, 화학적 분리 기술은 높은 알칼리성 고상 메틸화 방식으로 O -glycans 그대로 당 단백질로부터을 절단하는 40을 게츠 절차 동시 메틸화 화학적 분리를 용이 않는다. O의 -glycans, 그것은 단지 미리 절연 글리코에 도포단백질. 우리는 2013 년이 기술을 수정 트리 플루오로 아세트산을 통합하여 전체 미분 획 biofluids 및 균질 조직 샘플을 위해 적응 (TFA)을 가수 분해, 감소, 및 아세틸 화 단계. 또한 당지질 및 N에서 글리 칸을 해제 (33)이 추가 단계는 당 단백질에서 글리 칸을 -linked 및 변환 특유의 메틸화 – 및 – 아세틸 패턴 고유 GC-MS에 의해 분석을 용이하게 원래 그대로 글리 칸 폴리머 (41) (그림 2)로 구성 글리 칸 노드의 특성을 부분적으로 메틸화 된 알디 톨 아세테이트 (PMAAs, 그림 1),로. 33 궁극적으로,이 절차는 "코어 푸코 실화」, 「6 시알 릴", "한 GlcNAc를 이등분"및 "베타 1-6 분기"고유 당쇄 기능 직접 상대 정량에 기초하여 복소 biofluid 모든 글리 칸의 합성 세로 생성 – 각 하나의 GC-MS의 chromatograp에서 파생 된HIC 피크. 이 문서는 또한 메틸화의 최적화, 아세틸, 격리 및 상대 정량 모드의 개선과 함께 청소 단계를 제공합니다.
일반적으로, 탄당에서 부분적으로 메틸화 된 알디 톨 아세테이트의 성공적인 생산 (PMAAs)는 적은 어려움을 내포하고 N의 -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs의 성공적인 생산보다 더 강력합니다. 이 절차의 모든 단계에서 재생 될 때,이 현상의 뒤에 정확한 메커니즘은 알려져 있지만 탄당에 HexNAcs 대하여 고유 (오히려 수산기 이상)이 N의 아세틸 기의 고유 화학에 관련한다. 이 산 가수 분해에 관?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the College of Liberal Arts and Sciences of Arizona State University in the form of laboratory startup funds to CRB. It was also supported by a grant from Flinn Foundation (Grant No. 1977) and by the National Cancer Institute of the National Institutes of Health under Award Number R33CA191110. JA was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health Postbaccalalureate Research Education Program (PREP) under award number R25GM071798. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Sodium hydroxide beads | 367176 | Sigma-Aldrich | 20-40 mesh, reagent grade 97% |
0.9 mL Spin column | 69705 | Pierce division of ThermoFisher Scientific | Includes plugs and polyethylene frits |
GC-MS autosampler vial (silanized)* | C4000-9 | ThermoFisher Scientific | Target DP High Recovery Vial, 1.5 mL, 12 x 32 mm, Includes Teflon-lined pierceable caps |
1.5 mL polypropylene test tubes | 05-402-25 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
2 mL polypropylene test tubes | 05-408-138 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D8418 | Sigma-Aldrich | BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0% |
Iodomethane | I8507 | Sigma-Aldrich | Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99% |
Acetonitrile | A955-4 | ThermoFisher Scientific | Optima LC/MS |
Microcentrifuge | 75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424 |
13 x 100 glass test tube (silanized)* | 53283-800 | VWR | 13 x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish |
Caps for glass test tubes | 14-930-15D | ThermoFisher Scientific | Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner. |
Sodium chloride | S7653 | Sigma-Aldrich | >99.5% pure |
Chloroform | 4440-08 | Macron Fine Chemicals | |
Trifluoroacetic acid | 299537 | Sigma-Aldrich | 99% purified by redistillation for protein sequencing |
Sodium borohydride | 71321 | Fluka Analytical | 99% |
Ammonium hydroxide solution | 320145 | Sigma-Aldrich | NH3 content: 28.0 – 30.0% |
Methanol | AH230-4 | Honeywell Burdick & Jackson | HPLC grade |
Acetic acid | 320099 | Sigma-Aldrich | 99.70% |
Plastic vacuum desiccator | Any model of adequate size | FoodSaver | |
Acetic anhydride | 539996 | Sigma-Aldrich | 99.50% |
Dichloromethane | D143SK-4 | ThermoFisher Scientific | Stabilized HPLC grade |
Acetone | 9006-03 | J.T.Baker | Baker Analyzed |
Heated evaporation manifold (main unit) | pi18823 | ThermoFisher Scientific | Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function |
Heated evaporation manifold (overhead evaporator) | pi18826 | ThermoFisher Scientific | ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module |
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold | pi18816 | ThermoFisher Scientific | Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13mm dia test tubes, 13 holes (14 dia. x 45mm deep) |
Gas chromatograph | Model A7890 | Agilent | Equipped with CTC PAL autosampler |
Mass spectrometer | GCT Premier (Time-of-Flight) | Waters | |
Split-mode liner (deactivated / silanized) | 5183-4647 | Agilent | Containing a small plug of silanized glass wool |
DB-5ms GC column | 122-5532 | Agilent | 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness |
Chlorotrimethylsilane | 95541 | Sigma-Aldrich | |
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization) | EW-06536-30 | Cole-Parmer | 12" wide; 230 mm plate size |
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator. |