Glicanos Análise Node: uma abordagem de baixo para cima para Glycomics

Summary

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

Abstract

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides (“glycan nodes”) present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

Introduction

Os glicolípidos, glicoproteínas, proteoglicanos e glicosaminoglicanos constituem as quatro classes principais de hidratos de carbono complexos, heterogéneos colectivamente conhecidas como glicanos. Como componentes omnipresentes e integral da membrana do plasma, glicocálice, e a matriz extracelular e fluidos, glicanos participar em tais processos bioquímicos diversos como a endocitose, o tráfico intracelular, motilidade celular, a transdução de sinal, reconhecimento molecular, a activação do receptor, a adesão celular, a interacção hospedeiro-patogénio , intercelular comunicação, vigilância imunológica, e iniciação resposta imune. ¹ Presente em quase todos os domínios da vida, enzimas conhecidas como glicosiltransferases que constroem polímeros glicano agir em conjunto com glicosídeo hidrolases (também conhecido como glicosidases, que quebram glicanos) para a construção, remodelação, e finalmente produzir polímeros finalizado glicano ^2. Embora cada glicosiltransferase pode operar em diferentes glicoconjugados, uma glicosiltransferasegeralmente forja uma ligação glicosídica e linkage–anómero específico através da transferência do radical monossacárido de um determinado nucleótido activado dador de açúcar (por exemplo, GDP-fucose) a uma certa categoria de aceitadores nucleofílicos (por exemplo, um lípido, polipéptido, ácido nucleico, ou o cultivo oligossacárido). Estima-se que mais de 50% de proteínas (especialmente de membrana e proteínas secretoras) são pós-tradução modificada por glicosilação ³ cálculos combinatórios rudimentares fornecer uma apreciação para a variabilidade considerável, versatilidade e especificidade reconhecida às glicoproteínas de glicosilação.; Por exemplo, se um substrato de polipéptido tem apenas 10 locais de glicosilação e de cada local pode formar uma ligação glicosídica com uma das extremidades redutoras apenas 3 de monossacárido diferentes, então, teoricamente, a glicoproteína final pode assumir 3 ¹⁰ = 59049 identidades distintas. Em glicoproteínas, ligações glicosídicas geralmente formar com a cadeia lateral de azoto óf resíduos de asparagina na sequência Asn-X-Ser / Thr (X pode ser qualquer aminoácido excepto prolina) para se obter N-glicanos e ^2-hidroxilos de cadeia lateral de resíduos de serina e treonina para se obter ó-glicanos ^4. A composição da glycome de uma célula (ou seja, o seu complemento de produtos de glicosilação) é único e limitado, porque, com poucas exceções, glicosiltransferases exibem doador estrito, receptor, e especificidade de ligação. ⁵ glicoproteínas importante e abundante no plasma sanguíneo sofre glicosilação aberrante como consequência a jusante de expressão glycosyltransferase anormal e atividade devido a muitas condições patológicas, especialmente câncer e doenças inflamatórias ^6-24.

Principalmente devido a factores epigenética, o glycome é significativamente mais diverso, dinâmico e complexo do que o proteoma e transcriptoma ^25,26. Enquanto cerca de 1% do genoma de mamífero codifica a formação, modificação, emontagem de glicanos, ²⁷ de glicosilação procede de uma forma um contraste marcante-não-modelo orientado para polipéptido e biossíntese do ácido nucleico. A interação entre a quantidade relativa e atividade de enzimas de glicosilação e tais fatores ambientais como a disponibilidade de nutrientes e precursor em última instância, determina a natureza, taxa e extensão da glicosilação. ^5,28 embriogênese (por exemplo, determinação e diferenciação), ativação celular e progressão através a expressão do gene influência do ciclo celular (isto é, transcrição e tradução) e alterar a identidade e quantidade de glicosiltransferases disponíveis, cuja actividade é o determinante a montante imediata do perfil de glicano da célula. Porque (algumas das) a proliferativa, adesivo e propriedades invasivas das células cancerosas se assemelham aos de células embrionárias normais, alterações específicas em vias biossintéticas glicano (por exemplo, a acumulação de precursor, expressão desregulada, aberranmodificação t, truncamento estrutural, ou formação de romance) servem biomarcadores de câncer como universais que indicam várias etapas da formação do tumor, progressão, migração e invasão de ²⁹ Apesar de glicosilação é altamente complexo, é evidente que só algumas alterações na glicosilação pode habilitar carcinogênese e metástase.; Aparentemente, certos "aberrantes" produtos de glicosilação, de facto beneficiar células cancerosas, permitindo-lhes escapar reconhecimento imunológico e sobreviver às demandas de migração em ambientes intravascular e metastáticos inóspitas. ^28,30,31 Não surpreendentemente, os experimentos revelaram que interromper ou prevenir padrões de alteração a expressão do gene e a formação de glicano aberrante pode interromper a tumorigénese. ²⁹ no entanto, os glicanos aberrantes detectados numa amostra biofluid (por exemplo, urina, saliva, e o plasma sanguíneo ou no soro) pode não ser indicadores directos de cancro (ou outra doença), mas sim a jusante resultados de sutil, mas significativaalterações no sistema imunitário ou ramificações quantificáveis ​​de uma condição perniciosa num órgão imprevisível. ³²

Embora eles fornecem informações universal sobre a glycome, muitas técnicas Glycomics baseada em interação molecular (por exemplo, a lectina / matrizes de anticorpos e metabólica / rotulagem covalente) dependem da detecção de estruturas de glicano inteiros e não fornecem informações estruturais detalhadas sobre glicanos individuais. Em contraste acentuado, de espectrometria de massa (MS) pode ajudar a identificar e quantificar as estruturas de glicano individuais e revelar a informação estrutural como os sítios de ligação para núcleos de polipéptido. expressão ou actividade de uma única glicosiltransferase desregulada pode iniciar uma cascata de eventos moleculares prejudiciais em múltiplas vias de glicosilação. Porque cada glicosiltransferase pode operar em mais de um substrato glicoconjugada e em diferentes polímeros glicano crescimento, cascatas biossintéticas desregulados deu disproporcionalmente aumento da quantidade de apenas um produto glicano mas várias classes heterogêneas de glicanos aberrantes em fluidos intra ou extracelulares. ³³ No entanto, tais glicanos aberrantes originais são por vezes considerada impraticável como biomarcadores para o câncer ou outras patologias glicano-afetiva, porque, em comparação com o grande piscina de glicanos bem regulamentado, estes glicanos aberrantes representam uma fração muito pequena que pode muitas vezes permanecem indetectáveis ​​mesmo por técnicas tais altamente sensíveis como espectrometria de massa. Por exemplo, em fluidos corporais intra- e extracelulares, o amplo espectro de proteína de concentração (que abrange as oito ordens de grandeza) pode impedir a detecção de glicoproteínas escassos que são mascarados por as espécies mais abundantes. ³² Além disso, a determinação da actividade de glicosiltransferase continua a ser uma prática considerável e desafio teórico, porque muitas glicosiltransferases estão ausentes em fluidos biológicos clínicos ou se tornam inativos ex vivo. Apesar da dificuldade de consistenTLY detectar e quantificar quantidades ultra-pequenas de glicanos todo único, os praticantes de espectrometria de massa têm feito enormes progressos em direção a empregar glicanos intactas como marcadores clínicos. Desenvolvemos recentemente uma abordagem complementar à análise de glicanos intactos que, empregando GC-MS, facilita a detecção de todas as filiais-ponto constituinte e monossacarídeos específicos de ligação ( "nós glicano") que em conjunto conferem especificidade para cada glicano e em muitos casos servem directamente substitutos como moleculares que quantificam a atividade relativa do glycosyltransferase culpado (s).

Desde a sua primeira aplicação directa relatado para análise de glicano, em 1958, a cromatografia gasosa (GC) provou ser uma técnica poderosa para analisar per-metilada mono- e dissacáridos, ³⁴ determinar a sua anomericity e a configuração absoluta, e separá-los por análise de espectrometria de massa subsequente. ³⁵ entre 1984 e 2007, Ciucanu e colegasintroduzida e refinado uma técnica permetilação glicano à fase sólida que empregue o hidróxido de sódio e de iodometano, seguido por extracção líquido / líquido de glicanos permetilado utilizando água e clorofórmio. ^35,36 Entre 2005 e 2008, Kang e co-trabalhadores integrado um spin-horário abordagem -column na etapa permetilação. ^37,38 Em 2008, o grupo de pesquisa Goetz concebeu uma fase sólida quantitativa permetilação método glicano-profiling usando laser assistida por matriz dessorção de ionização (MALDI) espectrometria de massa para comparar e, eventualmente, caracterizar invasiva e não cancro da mama células -invasive; ³⁹ em seguida, em 2009, a equipe Goetz combinada enzimática e técnicas de liberação químicos para clivar o glicanos de glicoproteínas intactas em um esquema de permetilação em fase sólida altamente alcalina ⁴⁰ Embora o procedimento Goetz facilitado permetilação simultânea e liberação química. de glicanos S, foi aplicada apenas a glico pré-isoladoproteínas. Nós modificamos essa técnica em 2013 e adaptou-o para fluidos biológicos não fraccionadas inteiros e amostras de tecidos homogeneizados através da incorporação de ácido trifluoroacético (TFA) a hidrólise, redução e acetilação etapas. ³³ Estes passos adicionais também liberam glicanos de glycolipids e N -ligada glicanos de glicoproteínas e convertê -los em acetatos parcialmente metilados alditol (PMAAs, Figura 1), cujos padrões de metilação-e-acetilação distintivo facilitar a análise por GC-MS e exclusivamente caracterizar os nós de glicano constituintes no polímero glicano intacta inicial ⁴¹ (Figura 2). ³³ por fim, esta procedimento produz um retrato compósito de todos os glicanos de uma biofluid complexo baseado em quantificação directa, relativa de glicano características únicas, tais como "fucosilação núcleo", "6-sialilação", "GlcNAc bissector", e "beta 1-6 ramificação" – cada um derivado a partir de um único chromatograp CG-eMpico hic. Este artigo apresenta uma maior optimização do permetilação, acetilação, isolamento, e fases de limpeza, juntamente com a melhoria do modo de quantificação relativa.

Protocol

Atenção: Evite contato com a pele / olho com qualquer um dos reagentes utilizados neste experimento. Após a exposição, lave bem a área afetada com água e procurar assistência médica imediata. 1. permetilação e Glycan Extração Preparação coluna Obter um número de unidades de coluna de microcentrífuga de centrifugação das amostras a ser analisadas. Quebrar e retirar as tampas de tubos de reservatório de plástico. Colocar um filtro de microc…

Representative Results

Um cromatograma iónico total de corrente (TIC) que mostra permetilação bem sucedida, hidrólise, redução, e acetilação das amostras de plasma de sangue humano relativamente aos casos em que dois passos críticos permetilação foram incorrectamente executadas são mostrados na Figura 3. Rendimento absoluto do HexNAc Relativo ao Hexoses: <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="…

Discussion

Em geral, a produção bem sucedida de alditol acetatos parcialmente metilados (PMAAs) a partir de hexoses é cheio com menos dificuldades e é mais robusta do que a produção bem sucedida de N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. O mecanismo exato por trás desse fenômeno, uma vez que se desenrola em cada passo deste processo é desconhecida, mas devem estar relacionados com a química única do grupo acetil N (em vez de grupo hidroxila) que é exclusivo para HexNAc relação ao hexoses. O mecanismo su…

Materials

Sodium hydroxide beads	367176	Sigma-Aldrich	20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 mL Spin column	69705	Pierce division of ThermoFisher Scientific	Includes  plugs and polyethylene frits
GC-MS autosampler vial (silanized)*	C4000-9	ThermoFisher Scientific	Target DP High Recovery Vial, 1.5 mL, 12 x 32 mm, Includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 mL polypropylene test tubes	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
2 mL polypropylene test tubes	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane	I8507	Sigma-Aldrich	Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Microcentrifuge	75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)*	53283-800	VWR	13 x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride	S7653	Sigma-Aldrich	>99.5% pure
Chloroform	4440-08	Macron Fine Chemicals
Trifluoroacetic acid	299537	Sigma-Aldrich	99% purified by redistillation for protein sequencing
Sodium borohydride	71321	Fluka Analytical	99%
Ammonium hydroxide solution	320145	Sigma-Aldrich	NH3 content: 28.0 – 30.0%
Methanol	AH230-4	Honeywell Burdick & Jackson	HPLC grade
Acetic acid	320099	Sigma-Aldrich	99.70%
Plastic vacuum desiccator	Any model of adequate size	FoodSaver
Acetic anhydride	539996	Sigma-Aldrich	99.50%
Dichloromethane	D143SK-4	ThermoFisher Scientific	Stabilized HPLC grade
Acetone	9006-03	J.T.Baker	Baker Analyzed
Heated evaporation manifold (main unit)	pi18823	ThermoFisher Scientific	Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator)	pi18826	ThermoFisher Scientific	ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold	pi18816	ThermoFisher Scientific	Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13mm dia test tubes, 13 holes (14 dia. x 45mm deep)
Gas chromatograph	Model A7890	Agilent	Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer	GCT Premier (Time-of-Flight)	Waters
Split-mode liner (deactivated / silanized)	5183-4647	Agilent	Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column	122-5532	Agilent	30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane	95541	Sigma-Aldrich
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization)	EW-06536-30	Cole-Parmer	12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.