Glycan Düğüm Analizi: Glikomik A Aşağıdan yukarı Yaklaşım

Summary

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

Abstract

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides (“glycan nodes”) present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

Introduction

Glikolipidler, glikoproteinler, proteoglikanlar ve glikozaminoglikanlar topluca glukanlardır olarak bilinen karmaşık, heterojen karbonhidrat dört ana sınıfları oluşturmaktadır. Olarak plazma membranı, glikokaliksin ve hücre dışı matriks ve sıvıların her yerde ve integral parçaları, glukanlardır endositoz, hücre içi kaçakçılığı, hücre motilitesi, sinyal iletimi, moleküler tanıma, reseptör aktivasyonu, hücre yapışması, konak-patojen etkileşimi gibi çeşitli biyokimyasal süreçlerde katılmak hayatın neredeyse her alanında arası iletişim, immünosürveylansında ve immün yanıt inisiyasyon. ¹ Present, glikan polimerler inşa glıkosıltransferazlarla olarak bilinen enzimler glikozit oluşturmak için (glıkanları yıkmak da glikozidazlar olarak da bilinir), hidrolaz, şeklini ile birlikte hareket, ve sonuçta glikan polimerler ² kesinleşmiş üretirler. Her glıkosıltransferaz farklı glycoconjugates üzerinde çalışabilir olsa da, bir glıkosıltransferazgenel nükleofilik alıcılarının belirli bir kategori (örneğin, bir lipid, polipeptit, bir nükleik asit ya da giderek artan belirli bir aktif nukleotıt şeker donörü (örneğin, GDP-fukoz) bir monosakarit kısmını aktarmak bir nokta askı sistemine bağlanan ve anomeri özgü glikosidik bağı yanma oligosakkarit). Protein (özellikle membran ve salgı proteinleri) arasında% 50'den fazla translasyon sonrası glikosilasyon ile modifiye olduğu tahmin edilmiştir ³ Rudimentary kombinasyon hesaplamalar glikosilasyon ile glikoproteinlerin tanınan ölçüde değişkenlik, çok yönlülük ve özgüllük için takdir sağlar.; bir polipeptit alt-tabaka, sadece 10 glikosilasyon sitesi vardır ve her bir sitenin yalnızca 3 farklı azalan monosakkarit'in uçlarının 1 ile glikosidik bağ oluşturabilen, örneğin, daha sonra, teorik olarak, son glikoprotein 3 ¹⁰ = 59.049 farklı kimliklerinin varsayabiliriz. glikoproteinler olarak, glikozidik bağları genellikle yan zincir nitrojen ile o formuAsn-X-Ser f asparagin artıkları / Thr K O ⁴ -glycans vermek üzere serin ve treonin kökleri ² ve yan zincir hidroksilleri -glycans vermek üzere (X, prolin dışında herhangi bir amino asit olabilir). Birkaç istisna dışında, glıkosıltransferaz sıkı donör, alıcı, ve bağlantı özelliği göstermeyen, çünkü bir hücrenin glycome kompozisyonu (yani, glikosilasyon ürünlerinin tamamlayıcısı) eşsiz ve sınırlıdır. ⁵ Önemli ve bol kan plazma glikoproteinler bir alt sonucu olarak anormal glikosilasyonu acı anormal glikosiltransferaz ve faaliyetinin nedeniyle birçok patolojik koşullarda, özellikle de, kanser ve inflamatuar hastalıklar. ^6-24

Temelde epigenetik faktörler nedeniyle, glycome memeli genomunun yaklaşık% 1'i oluşumu, modifikasyon kodlar iken. Anlamlı ^25,26 proteomu ve transcriptome daha, çeşitli dinamik ve karmaşık veGlikanların takımı olmayan bir şablon odaklı şekilde-belirgin bir kontrast ²⁷ glikosilasyon ilerler polipeptidi ve nükleik asit biyosentezi için. Glikozilasyon enzimler ve besin ve öncü durumuna gibi çevresel faktörlerin göreceli miktarı ve etkinliği arasındaki etkileşim nihayetinde glikosilasyon doğasını, hızını ve kapsamını belirler. ^5,28 Embriyo (örneğin, kararlılık ve farklılaşma), hücresel aktivasyonu ve ilerlemesi yoluyla hücre döngüsü etkisi gen ifadesi (yani, transkripsiyon ve çeviri) ve kimin aktivite hücrenin glikan profilinin hemen yukarı belirleyicisi olan mevcut glikoziltransferazların kimliğini ve miktarını değiştirebilir. (Bazıları) proliferatif olduğundan, yapıştırıcı ve kanserli hücrelerin bir invaziv sıradan embriyojenik hücreler, glıkan biyosentetik yollar (örneğin, ön-madde birikimi, deregüle sentezleme, aberran belirli değişikliklerin benzemektedir. t modifikasyonu, yapısal kesme veya yeni oluşumu) glikozilasyon açıkça glikozilasyon sadece birkaç değişiklikler karsinogenezini ve metastaz etkinleştirebilirsiniz, oldukça karmaşık olmasına rağmen tümör oluşumu, ilerlemesi, göç ve işgali ²⁹ çeşitli aşamalarında gösterdiği gibi evrensel kanser biyobelirteçlerini hizmet; görünüşe göre, bazı "anormal" glikozilasyon ürünleri gerçekten bağışıklık tanıma kaçmasına ve daralan damar içi ve metastatik ortamlarda göç taleplerini hayatta kalmalarını sağlayarak kanserli hücreleri yarar. ^28,30,31 şaşırtıcı değil, deneyler değişmiş kalıplarını bozan veya engelleyen ortaya koymuştur gen ekspresyonu ve anormal glikan oluşumu tümörogenez durdurabilir. ²⁹ Bununla birlikte, bir biyo-sıvı numune (örneğin, idrar, tükürük, kan plazma veya serum) 'de tespit edilen anormal glıkanlar doğrudan kanser göstergeleri (veya başka bir hastalık), daha çok alt olmayabilir ince ama önemli sonuçlarıBağışıklık sistemi veya öngörülemeyen bir organında bir zararlı durumun ölçülebilir yansımaları değişiklikler. ³²

Onlar glycome hakkında evrensel bilgi, pek çok moleküler etkileşim tabanlı Glikomik teknikleri (örneğin, lektin / antikor dizileri ve metabolik / kovalent etiketleme) sağlasa da tüm glıkan yapıların tespiti bağlıdır ve bireysel glukanlardır hakkında detaylı yapısal bilgi vermemektedir. belirgin aksine, kütle spektrometresi (MS) tanımlanmasına yardımcı ve bireysel glikan yapıları ölçmek ve polipeptit çekirdeklerine eki siteleri gibi yapısal bilgileri açığa çıkartabilir. Deregüle ifade veya sadece bir glıkosıltransferaz aktivitesi çok glikosilasyon yolakları zararlı moleküler olaylar kaskadını başlatabilir. Her glıkosıltransferaz birden fazla glycoconjugate alt tabaka üzerinde ve farklı büyüyen glikan polimerler arasında çalışabilir, çünkü deregüle biyosentetik kaskadlar dispropor verimarası olarak tek glikan ürünün miktarda ancak hücre içi veya dışı sıvılarda anormal glukanlardır birkaç heterojen sınıflar arttı. ³³ Ancak, bu tür eşsiz anormal glukanlardır bazen kanser nedeniyle veya diğer glıkan-duygusal patolojiler için biyomarkerların olarak pratik olarak kabul edilir, büyük havuz ile karşılaştırıldığında ve glikanlar iyi düzenlenmiş, bu anormal glukanlardır olabilir sık ​​sık hatta kütle spektrometresi gibi son derece hassas tekniklerle saptanamaz kalır çok küçük bir bölümünü temsil etmektedir. Örneğin, hücre içi ve hücre dışı vücut sıvılarında (büyüklük sekiz emir açıklıklı) geniş protein konsantrasyonu spektrum daha bol türler tarafından maskelenir kıt glikoproteinler tespiti önleyebilirsiniz. ³² Dahası, glıkosıltransferaz aktivitesinin belirlenmesinde pratik bir hayli kalır ve birçok glıkosıltransferaz klinik Biosıvılar içinde bulunmayan ya da ex vivo inaktif hale çünkü teorik meydan. consisten zorluğuna rağmently tespit ve eşsiz bütün glukanlardır ultra dakika miktarlarda ölçülmesi, kütle spektrometresi uygulayıcıları klinik belirteç olarak bozulmamış glikanları istihdam yönünde büyük atılımlar yaptık. Biz son zamanlarda GC-MS kullanılarak, birlikte her glıkan ve birçok teklik vermek tüm kurucu şube noktası ve bağlantı özgü monosakkaritler ( "glikan düğümler") tespitini kolaylaştırır, bozulmamış glukanlardır analizi için tamamlayıcı bir yaklaşım geliştirdik olgular doğrudan kusurlu glıkosıltransferaz (lar) göreli etkinliğini ölçmek moleküler temsilciler hizmet vermektedir.

İlk 1958 glıkan analizi doğrudan uygulama rapor için, gaz kromatografisi (GC), ³⁴ başına metillenmiş mono- ve disakaritler analiz bunların anomericity ve mutlak konfigürasyonunu belirleyebilir ve daha sonra kütle spektrometrik analizi için ayırmak için güçlü bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. ³⁵ 1984 ve 2007, Ciucanu ve meslektaşları arasındatanıtılan ve 2005 ve 2008 yılları arasında su ve kloroform. ^35,36 kullanılarak permetilatlı glukanlardır sıvı / sıvı ekstraksiyon ardından sodyum hidroksit ve iyodometan kullanılan bir katı-faz glikan permethylation tekniği, rafine, Kang ve arkadaşları, bir zaman tasarrufu falso entegre permethylation adımına -Kolon yaklaşım. 2008 ^37,38, Goetz araştırma grubu karşılaştırarak ihtimali olan ve olmayan ayırt matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometrisi kullanılarak glıkan-profil yöntemi permethylation kantitatif bir katı-faz icat -invasive meme kanseri hücreleri ³⁹ daha sonra, 2009 yılında, Goetz ekibi kombine enzimatik ve kimyasal salınım teknikleri yüksek alkali katı faz permethylation şemasında o -glycans bozulmamış glikoproteinler gelen ayırmak için ⁴⁰ Goetz prosedürü eşzamanlı permethylation ve kimyasal salınımını kolaylaştırdı rağmen. o -glycans arasında, sadece önceden izole glikoproteinin uygulandıproteinler. Biz, 2013 yılında bu tekniği değiştirilmiş ve trifloroasetik asit eklenerek bütün bölünmemiş Biofluids ve homojenize doku örnekleri için uyarlanmış (TFA), hidroliz, indirgeme ve asetilleme adımlarını. Ayrıca, glikolipidler ve N'den glikanlar serbest ³³ Bu ilave adım glikoproteinlerden glıkanları -bağlı dönüştürmek ayırt edici metilasyon-ve-asetilasyon desenler benzersiz GC-MS tarafından analiz kolaylaştırmak orijinal bozulmamış glikan polimer ⁴¹ (Şekil 2) kurucu glıkan düğümleri karakterize kısmen metillenmiş alditol asetatlar (PMAAs, Şekil 1), içine onları. ³³ Sonuçta, bu prosedür, "göbek fukosilasyonu", "6-sialilasyon", "GIcNAc'nin" ve "p 1-6 dal" benzersiz glıkan özelliklerin doğrudan görece nicelenmesine dayanan kompleks biyo-sıvı tüm glıkanların bileşik portre üretir – her biri tek bir GC-MS kromatografisi yolu türetilenhic zirve. Bu makalede başka permethylation optimizasyonu, asetilasyonunu, izolasyon ve nispi ölçümü modunda gelişmeler ile birlikte temizlik aşamaları sunar.

Protocol

Dikkat: Bu deneyde kullanılan maddelerinden biriyle cilt / göz temasından kaçının. maruziyet üzerine, su ile iyice etkilenmiş bölgeyi yıkayın ve derhal doktora başvurun. 1. Permethylation ve Glycan Ekstraksiyon Sütun Hazırlama Alınan numuneler tahlil için gibi birçok mikrofuge'ye spin kolon birimleri edinin. Kırmak ve plastik rezervuar tüp kapaklarını çıkarın. Her rezervuar tüp içinde bir mikrofuge'de küçük filtresi yerle?…

Representative Results

Göre iki kritik permethylation adım yanlış infaz edildiği durumlarda başarılı permethylation, hidroliz, azaltma, ve insan kan plazma örneklerinin asetilasyonunu gösteren bir toplam iyon akımı kromatogram (TIC) Şekil 3 'de gösterilmiştir. Heksozların için HexNAcs Görece mutlak Verim: N -acetylhexosamine (HexNAc…

Discussion

Genel olarak, heksozlarla kısmen metillenmiş alditol asetatlar başarılı üretim (PMAAs) Daha az zorluklarla doludur ve N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs başarılı üretiminden daha sağlamdır. Bu prosedürün her aşamasında dışarı oynar gibi bu fenomenin arkasında tam mekanizması bilinmemekle beraber heksozlarla için HexNAcs göreceli özgü (yerine hidroksil grubuna göre) N-asetil grubunun eşsiz kimyaya ilgili olmalıdır. Asit hidrolizi ile ilgili olarak bunun altında yatan mekani…

Materials

Sodium hydroxide beads	367176	Sigma-Aldrich	20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 mL Spin column	69705	Pierce division of ThermoFisher Scientific	Includes  plugs and polyethylene frits
GC-MS autosampler vial (silanized)*	C4000-9	ThermoFisher Scientific	Target DP High Recovery Vial, 1.5 mL, 12 x 32 mm, Includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 mL polypropylene test tubes	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
2 mL polypropylene test tubes	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane	I8507	Sigma-Aldrich	Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Microcentrifuge	75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)*	53283-800	VWR	13 x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride	S7653	Sigma-Aldrich	>99.5% pure
Chloroform	4440-08	Macron Fine Chemicals
Trifluoroacetic acid	299537	Sigma-Aldrich	99% purified by redistillation for protein sequencing
Sodium borohydride	71321	Fluka Analytical	99%
Ammonium hydroxide solution	320145	Sigma-Aldrich	NH3 content: 28.0 – 30.0%
Methanol	AH230-4	Honeywell Burdick & Jackson	HPLC grade
Acetic acid	320099	Sigma-Aldrich	99.70%
Plastic vacuum desiccator	Any model of adequate size	FoodSaver
Acetic anhydride	539996	Sigma-Aldrich	99.50%
Dichloromethane	D143SK-4	ThermoFisher Scientific	Stabilized HPLC grade
Acetone	9006-03	J.T.Baker	Baker Analyzed
Heated evaporation manifold (main unit)	pi18823	ThermoFisher Scientific	Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator)	pi18826	ThermoFisher Scientific	ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold	pi18816	ThermoFisher Scientific	Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13mm dia test tubes, 13 holes (14 dia. x 45mm deep)
Gas chromatograph	Model A7890	Agilent	Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer	GCT Premier (Time-of-Flight)	Waters
Split-mode liner (deactivated / silanized)	5183-4647	Agilent	Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column	122-5532	Agilent	30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane	95541	Sigma-Aldrich
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization)	EW-06536-30	Cole-Parmer	12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.