Beoordeling van Myofilament Ca²⁺ Gevoeligheid Onderliggende Cardiac excitatie-contractie Coupling

Summary

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Abstract

Hartfalen en hartritmestoornissen zijn de belangrijkste oorzaken van sterfte en ziekte wereldwijd. Toch blijft het mechanisme van de pathogenese en myocardiale storing in het zieke hart volledig worden opgehelderd. Recente overtuigend bewijs toont aan dat veranderingen in de myofilament Ca2 ⁺ gevoelige invloed intracellulair Ca2 ⁺ homeostase en ionkanaal activiteiten in cardiomyocyten, essentiële mechanismen verantwoordelijk voor de cardiale actiepotentiaal en inkrimping van gezonde en zieke harten. Sterker nog, de activiteiten van ionkanalen en transporteurs onderliggende cardiale actiepotentialen (bijvoorbeeld Na ^+, Ca ²⁺ en K ⁺ kanalen en de Na ⁺ -Ca ²⁺ wisselaar) en intracellulaire Ca ²⁺ hanteren eiwitten (bijv., Ryanodinereceptor en Ca ²⁺ -ATPase in sarcoplasmatisch reticulum (SERCA2a) of fosfolamban en de fosforylatie) worden gewoonlijk gemeten evaluat de fundamentele mechanismen van cardiale excitatie-contractie (EG) koppeling. Zowel elektrische activiteiten in de membraan en intracellulaire Ca2 ⁺ veranderingen de triggersignalen van EC koppeling, terwijl myofilament de functionele eenheid van samentrekking en ontspanning en myofilament Ca2 ⁺ gevoeligheid noodzakelijk is in de uitvoering van myofibril prestaties. Niettemin weinig studies nemen myofilament Ca2 ⁺ gevoeligheid in de functionele analyse van het myocardium tenzij het ​​het focus van de studie. We beschrijven een protocol dat sarcomeer verkorting / re-verlenging en het intracellulaire Ca2 ⁺ level behulp Fura-02:00 (ratiometrische detectie) en de veranderingen van myofilament Ca2 ⁺ gevoeligheid van cardiale myocyten van ratteharten evalueren meet. Het belangrijkste doel is om te benadrukken dat myofilament Ca ²⁺ gevoeligheid moet in de EG-koppeling in aanmerking worden genomen voor mechanistische analyse. Uitgebreid onderzoek van de iop de kanalen, ion transporters, intracellulaire Ca ²⁺ handling en myofilament Ca ²⁺ gevoeligheid die myocyte contractiliteit in gezonde en zieke harten ten grondslag liggen zal waardevolle informatie voor het ontwerpen van meer effectieve strategieën van translationeel en therapeutische waarde.

Introduction

Cardiale excitatie-contractie (EG) koppeling de grondschema voor de analyse mechanische eigenschappen van het myocardium, dwz de contractiele functie van het hart ^1,2. EG koppeling wordt geïnitieerd door membraandepolarisatie secundair aan de activiteiten van sarcolemmale ionkanalen (bijvoorbeeld het spanningsgevoelige Na ⁺ kanaal, welke kan worden gemeten met patch-clamp techniek). Daaropvolgende activering van spanningsafhankelijke L-type Ca ²⁺ kanalen (LTCCs) en Ca ²⁺ influx via LTCCs leiden tot het grootste deel van Ca ²⁺ vrijkomen door middel van ryanodinereceptor (RyRs), het verhogen van de cytosolische Ca ²⁺ concentratie van het nanomolair (nM ) naar micromolair (uM) niveau. Een dergelijke verhoging van cytosolisch Ca2 ⁺ bevordert Ca2 ⁺ binding aan troponine C (TnC) in dunne filamenten en wekt conformatieveranderingen van het filament complex aan de actine-myosine interactie vergemakkelijken en bereikt myocardial contractie ^3. Omgekeerd, het cytosolische Ca2 ⁺ weer wordt uptaken terug in het sarcoplasmatisch reticulum (SR) via Ca2 ⁺ -ATPase in SR (SERCA2a) of buiten de myocyten geëxtrudeerd via de Na ⁺ / Ca2 ⁺ uitwisselaar en plasmalemmal Ca2 ⁺ ATPase ^1,2. Bijgevolg is de daling van cytosolische Ca2 ⁺ aanzet conformatieveranderingen van dunne filamenten terug naar de oorspronkelijke toestand, waardoor de dissociatie van actine-myosine en myocyt ontspanning ^1-3. In dit schema wordt de activiteit van SERCA2a algemeen beschouwd als de snelheid van myocardiale relaxatie bepalen omdat het goed is voor 70-90% van cytosolische Ca ² verwijderd in de meeste zoogdiercellen hartcellen ^1. Als zodanig abnormale Ca ²⁺ behandeling door LTCC, RyR en SERCA2a, etc. werd beschouwd als de belangrijkste mechanismen voor de verminderde contractiliteit en ontspanning in het zieke hart ^1-4.

<p class="jove_content"> In werkelijkheid, vrije cytosolische Ca ²⁺ die fungeert als de boodschapper in EC koppeling is goed voor ongeveer 1% van de totale intracellulaire Ca ²⁺ en de meerderheid van Ca ²⁺ is gebonden aan de intracellulaire Ca ²⁺ buffers ^5,6. Dit komt door het feit dat verschillende Ca2 ⁺ buffers zijn overvloedig in cardiomyocyten, bijvoorbeeld membraanfosfolipiden, ATP, creatinefosfaat, calmoduline, parvalbumine, myofibril TnC, myosine, SERCA2a en calsequestrin de SR. ^5,6,7. Onder hen, SERCA2a en TnC de overheersende Ca2 ⁺ buffers ^5,6,7. Bovendien Ca2 ⁺ binding aan de buffers is een dynamisch proces in zenuwtrekking (bijvoorbeeld, 30-50% Ca2 ⁺ bindt aan TnC en losmaken van het tijdens Ca2 ⁺ transiënten ⁷⁾ en de verandering in Ca2 ⁺ binding veroorzaken aanvullende "vrijgeven" van vrij Ca2 ⁺ het cytosol, leidt tot veranderingen van de intracellulaire Ca2 ⁺ concentration. Derhalve verstoring van de intracellulaire Ca2 ⁺ niveau induceert myofilament abnormale bewegingen, die de voorlopers van contractiele dysfunctie en hartritmestoornissen ^8,9 zijn. Vele factoren (zowel fysiologische en pathologische) kunnen de bronnen van post-transcriptionele modificaties van myofilament eiwitten, die myofilament Ca ²⁺ buffering en myofilament Ca ²⁺ gevoeligheid ^8-10 beïnvloeden. Onlangs werd gerapporteerd dat mutaties in myofilament eiwitten verhogen Ca2 ⁺ bindingsaffiniteit en intracellulaire Ca2 ⁺ handling, triggering pauze-afhankelijke versterking Ca2 ⁺ transiënten, abnormale Ca2 ⁺ afgifte, en hartritmestoornissen ^8. In overeenstemming met dit concept, hebben we ook aangetoond dat myofilament Ca2 ⁺ desensibilisatie bij hypertensieve ratten harten secundair aan de up-regulatie van neuronale stikstofoxidesynthase is geassocieerd met verhoogde diastolische en systolische Ca2 ⁺ niveaus^11, die op zijn beurt, verhoogt de kwetsbaarheid van de LTCC om Ca2 ⁺ -afhankelijke ¹² inactivering. Daarom myofilament Ca2 ⁺ gevoeligheid is een "actieve" regelaar van intracellulair Ca2 ⁺ homeostase en myocyt contractiele functie. Het is noodzakelijk geworden om interacties tussen myofilament en Ca ²⁺ analyseren de behandeling van eiwitten voor grondig onderzoek van myocyten EG koppeling en hartfunctie.

We beschrijven een protocol dat de veranderingen van myofilament Ca2 ⁺ gevoeligheid geïsoleerde cardiomyocyten beoordeelt. Uitgebreide analyse van de intracellulaire Ca ²⁺ profiel, zal myofilament Ca ²⁺ gevoeligheid en krimp nieuwe mechanismen ontgraven onderliggende myocard mechanica.

Protocol

Het protocol is in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren gepubliceerd door de National Institutes of Health van de VN (NIH publicatie nr 85-23, herzien 1996). Het werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Seoul National University (IACUC goedkeuring nr .: SNU-101213-1). 1. Buffer Voorbereiding (tabel materialen en apparatuur) Bereid 300 ml verse isolatieoplossing op de dag van het experiment (in mM: NaCl, 135; KC…

Representative Results

LV myocyten zijn geïsoleerd van normale en hypertensieve rat harten. Staafvormige myocyten met duidelijke strepen (die sarcomeren) en stabiele samentrekt ingevolge veldstimulatie worden beschouwd als de optimale myocyten zijn en zijn gekozen voor opname (Figuur 2A). In de in F igure 2A bijvoorbeeld een Fura 02:00-geladen LV myocyten is horizontaal geplaatst en het diafragma van de camera wordt ingesteld dat de myocyten neemt het grootste deel van het ve…

Discussion

Hier beschrijven we de protocollen om veranderingen van myofilament Ca ²⁺ gevoeligheid in enkele geïsoleerde hartspiercel beoordelen en benadrukken het belang van het meten van deze parameter naast elektrofysiologische eigenschappen, intracellulaire Ca ²⁺ transiënten en myofilament dynamiek. Dit komt omdat de opname van een of twee van de parameters niet de onderliggende mechanismen cardiale contractie en ontspanning kan expliciteren. In tegenstelling tot conventionele werkwijzen die myocyten con…

Materials

Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
		CFA300
		PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM