Évaluation des myofilaments Ca²⁺ Sensibilité sous-jacente cardiaque Excitation-contraction Couplage

Summary

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Abstract

L'insuffisance cardiaque et des arythmies cardiaques sont les principales causes de mortalité et de morbidité dans le monde entier. Cependant, le mécanisme de la pathogenèse et de dysfonctionnement du myocarde dans le cœur malade reste à être pleinement clarifié. Des preuves convaincantes récentes démontrent que les changements dans la sensibilité du myofilament Ca affectent Ca intracellulaire ²⁺ activités de l' homéostasie et canaux ioniques dans les myocytes cardiaques, les mécanismes essentiels responsables du potentiel d'action cardiaque et la contraction dans les cœurs sains et malades. En effet, les activités des canaux ioniques et des transporteurs sous – jacents potentiels d'action cardiaques (par exemple, Na ^+, Ca ²⁺ et K ⁺ et des canaux ²⁺ échangeur Na ⁺ -Ca) et le ^{Ca2 +} intracellulaire des protéines (par exemple , la manipulation., Les récepteurs de la ryanodine et Ca ^{2 +} -ATPase dans réticulum sarcoplasmique (SERCA2a) ou phospholambane et sa phosphorylation) sont classiquement mesurée Evalumangé les mécanismes fondamentaux de cardiaque excitation-contraction (CE) de couplage. Les deux activités électriques dans la membrane et les changements Ca2 ⁺ intracellulaires sont les signaux de déclenchement de couplage CE, alors que myofilament est l'unité fonctionnelle de contraction et de relaxation, et la sensibilité ^de myofilament Ca est impératif dans la mise en œuvre de la performance myofibrille. Néanmoins, peu d' études intègrent la sensibilité ^de myofilament Ca dans l'analyse fonctionnelle du myocarde sauf si elle est l'objet de l'étude. Ici, nous décrivons un protocole qui mesure sarcomère shortening / re-allongement et le intracellulaire niveau Ca ²⁺ en utilisant Fura-2 AM (de détection ratiométrique) et d' évaluer les changements de la sensibilité ^de myofilament Ca dans les myocytes cardiaques de coeurs de rats. L'objectif principal est de souligner que la sensibilité myofilament Ca doit être pris en considération dans le couplage CE pour l' analyse mécaniste. enquête approfondie sur isur les canaux, les transporteurs d'ions Ca ²⁺ intracellulaire, la manipulation et la sensibilité ^de myofilament Ca qui sous – tendent myocytes contractilité dans les cœurs sains et malades fournira des informations précieuses pour la conception de stratégies plus efficaces de translation et de valeur thérapeutique.

Introduction

Excitation-contraction cardiaque (EC) de couplage est le schéma fondamental pour analyser les propriétés mécaniques du myocarde, à savoir la fonction contractile du cœur ^1,2. Couplage C'est initiée par dépolarisation de la membrane secondaire par rapport à l'activité des canaux ioniques sarcolemmiques (par exemple le canal Na ⁺ voltage-dépendants, qui peut être mesurée par des techniques de patch-clamp). L' activation subséquente de type L voltage-dépendants canaux ^{Ca2 +} (LTCCs) et influx de Ca ²⁺ par LTCCs déclencher la masse de Ca ²⁺ libération par le biais des récepteurs de la ryanodine (les RyRs), augmentant ainsi la cytosolique concentration en Ca ²⁺ du nanomolaire (nM ) micromolaire (uM) niveau. Une telle augmentation de Ca ²⁺ cytosolique favorise la liaison à ^{Ca2 +} troponine C (CTN) en filaments fins et induit des changements conformationnels du complexe du filament pour faciliter l'interaction actine-myosine et atteint myocardial contraction ^3. A l' inverse, le Ca ²⁺ cytosolique est re-uptaken retour dans le réticulum sarcoplasmique (SR) par le ^{Ca2 +} ATPase dans SR (SERCA2a) ou est extrudé hors de la myocytes via ²⁺ échangeur Na ⁺ / Ca et le plasmiques Ca ²⁺ ATPase ^1,2. Par conséquent, la baisse de Ca cytosolique ²⁺ incite des changements conformationnels de minces filaments à l'état d' origine, ce qui entraîne la dissociation de l' actine-myosine et myocytes relaxation ^1-3. Dans ce système, l'activité de SERCA2a est généralement considérée pour déterminer la vitesse de relaxation du myocarde , car elle représente 70-90% de ^{Ca2 +} cytosolique retrait dans la plupart des cellules cardiaques mammaliennes ^1. En tant que tel, anormale ^{Ca2 +} manipulation par LTCC, RyR et SERCA2a, etc. ont été considérés comme les principaux mécanismes de troubles de la contractilité et de détente au cœur malade ^1-4.

<p class="jove_content"> En réalité, libre cytosolique Ca ²⁺ qui fonctionne comme le messager dans les comptes de couplage CE pour environ 1% du total intracellulaire de ^{Ca2 +} et la majorité de Ca ²⁺ est lié à intracellulaires ^Ca2 tampons ^5,6. Ceci est dû au fait que les différents tampons de ^{Ca2 +} sont abondants dans les myocytes cardiaques, par exemple, des phospholipides membranaires, l' ATP, phosphocréatine, la calmoduline, la parvalbumine, myofibril TnC, la myosine, SERCA2a et calséquestrine dans le RP. ^5,6,7. Parmi eux, SERCA2a et TNC sont prédominants ^{Ca2 +} tampons ^5,6,7. En outre, Ca ²⁺ se liant à ses tampons est un processus dynamique au cours de contraction (par exemple, 30-50% de Ca ²⁺ se lie à TnC et désolidarisé pendant Ca ^{2 +} transitoires ⁷⁾ et le changement de Ca ²⁺ cause supplémentaire de liaison "libérer" de la libre Ca ²⁺ dans le cytosol, les résultats dans les altérations du ^{Ca2 *} intracellulaire concntration. Par conséquent, la perturbation du niveau intracellulaire de ^{Ca2 +} induit des mouvements anormaux myofilament, qui sont les précurseurs du dysfonctionnement contractile et l' arythmie ^8,9. De nombreux facteurs ( à la fois physiologiques et pathologiques) peuvent être des sources de modifications post-transcriptionnelles de protéines de myofilaments qui influencent la sensibilité ^de myofilaments tampon ^{Ca2 +} et Ca myofilaments ^8-10. Récemment, il a été rapporté que des mutations dans les protéines myofilament augmentent le Ca ²⁺ affinité de liaison et intracellulaire de ^{Ca2 +} manipulation, déclenchant une pause-dépendante potentialisation de Ca ^{2 +} transitoires, Ca ²⁺ libération anormale, et arythmies ^8. Conformément à ce concept, nous avons également montré que myofilament Ca ²⁺ désensibilisation dans les cœurs de rats hypertendus secondaires à la régulation positive de la synthase neuronale de l' oxyde nitrique est associée à diastolique élevée et systolique niveaux de ^{Ca2 +11,} qui , à son tour, augmente la vulnérabilité du LTCC à l' inactivation dépendante ^de Ca ^12. Par conséquent, la sensibilité ^de myofilament Ca est un régulateur "actif" de ^{Ca2 +} intracellulaire homéostasie et myocytes fonction contractile. Il est devenu nécessaire d'analyser les interactions entre myofilament et ^{Ca2 +} manipulation des protéines d' une enquête approfondie des myocytes couplage CE et la fonction cardiaque.

Ici, nous décrivons un protocole qui permet d' évaluer les changements de la sensibilité ^de myofilament Ca dans les myocytes cardiaques isolés. Une analyse complète des ^{Ca2 +} intracellulaire profil, la sensibilité et la contraction ^de myofilament Ca va déterrer de nouveaux mécanismes mécanique du myocarde sous – jacents.

Protocol

Le protocole est en conformité avec le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire publiées par les Instituts nationaux de la santé des Nations Unies (NIH Publication No. 85-23, révisée en 1996). Elle a été approuvée par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Université nationale de Séoul (approbation IACUC no .: SNU-101213-1). 1. Préparation du tampon (tableau matériel et équipement) Préparer 300 ml …

Representative Results

myocytes LV sont isolés des coeurs de rats normaux et hypertendus. Myocytes en forme de tige avec des stries claires (représentant sarcomères) et des contractions stables en réponse à une stimulation de champ sont considérés comme les myocytes optimales et sont sélectionnés pour les enregistrements (figure 2A). Dans l'exemple représenté en F igure 2A, une Fura 2 heures LV myocytes est chargé en position horizontale et l'ouverture de l…

Discussion

Ici, nous décrivons les protocoles pour évaluer les changements de la sensibilité ^de myofilament Ca en simple myocytes cardiaques isolés et soulignons l'importance de mesurer ce paramètre aux côtés de propriétés électrophysiologiques, intracellulaires Ca ^{2 +} transitoires, et la dynamique des myofilaments. En effet, les enregistrements d'une ou deux des paramètres ne peuvent pas expliquer les mécanismes sous-tendant la contraction cardiaque et la relaxation. A la différence des …

Materials

Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
		CFA300
		PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM