This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.
Сердечная недостаточность и нарушения ритма сердца являются основными причинами смертности и заболеваемости во всем мире. Тем не менее, механизм патогенеза и миокардиальной неисправностью в больном сердце остается полностью выяснены. Последние убедительные данные свидетельствуют о том, что изменения в myofilament Ca 2+ чувствительности влияет на внутриклеточный Ca 2+ гомеостаз и ионных каналов деятельность в кардиомиоциты, основные механизмы , ответственные за потенциала действия сердца и сжатия у здоровых и больных сердец. Действительно, деятельность ионных каналов и транспортеров , лежащие в основе потенциалов действия сердца (например, Na +, Ca 2+ и K + каналов и Na + -Ca 2+ обменника) и внутриклеточного Са 2+ обработки белки (например., Рианодин рецепторы и Ca 2+ -АТФазы в саркоплазматического ретикулума (SERCA2a) или phospholamban и его фосфорилирования) традиционно измеряется в оценели фундаментальных механизмов сердечного возбуждения-сжатия (EC) муфты. Обе электрические действия в мембране и внутриклеточных изменений Са 2+ являются синхросигналы сцепления ЕС, в то время как myofilament является функциональной единицей сокращения и расслабления, и myofilament Ca 2+ чувствительности является обязательным при осуществлении миофибрилл производительности. Тем не менее, несколько исследований включают myofilament Ca 2+ чувствительности в функциональном анализе миокарда , если он не находится в центре внимания исследования. Здесь мы опишем протокол , который измеряет саркомер сокращения / повторного удлинения и внутриклеточный уровень Са 2+ с использованием Фура-2 AM (ратиометрический обнаружения) и оценить изменения myofilament Ca 2+ чувствительности в кардиомиоцитов из сердца крысы. Основная цель состоит в том, чтобы подчеркнуть , что myofilament Ca 2+ чувствительности следует принимать во внимание в муфте EC для механистического анализа. Комплексное исследование Iна каналах, ионные транспортеры, внутриклеточная обработки Ca 2+ и Ca 2+ myofilament чувствительности, лежащих в основе миоцитов сократимость у здоровых и больных сердца предоставит ценную информацию для разработки более эффективных стратегий поступательной и терапевтическую ценность.
Сердечный возбуждения-сжатия (EC) связи является основной схемой для анализа механических свойств миокарда, т.е. сократительной функции сердца 1,2. Муфта EC инициируется деполяризации мембраны вторичным по отношению к деятельности сарколемных ионных каналов (например, напряжения закрытого Na + канал, который можно измерить с помощью методов патч-зажим). После активации напряжения закрытого L-типа Ca 2+ каналы (LTCCs) и Са 2+ приток через LTCCs вызывают большую часть Ca 2+ через выпуск рианодиновых рецепторов (RyRs), увеличение концентрации цитозольного Са 2+ из наномолярной (Nm ) до микромолярные (мкМ) уровень. Такое увеличение цитозольного Ca 2+ способствует Са 2+ связывания с тропонина С (TNC) в тонких нитях и вызывает конформационные изменения комплекса синтетических нитей , чтобы облегчить взаимодействие актина-миозина и достигает myocardiАль контракции 3. С другой стороны , цитозольного Ca 2+ повторно uptaken обратно в саркоплазматического ретикулума (СР) через Ca 2+ -АТФазы в SR (SERCA2a) или выдавливают из миоцита через Na + / Ca 2+ обменника и plasmalemmal Ca 2+ АТФазы 1,2. Следовательно, снижение цитозольного Ca 2+ подстрекает конформационные изменения тонких нитей обратно в исходное состояние, что приводит к диссоциации актин-миозин и миоцитов релаксации 1-3. В этой схеме, активность SERCA2a , как правило , считается , чтобы определить скорость релаксации миокарда , поскольку она составляет 70 – 90% от цитозольной удаления Ca 2+ в большинстве млекопитающих клеток сердца 1. В качестве такого, ненормального обработка Ca 2+ LTCC, RyR и SERCA2a и т.д. были рассмотрены основные механизмы нарушенной сократимости и релаксации в сердце больном 1-4.
<p class="jove_content"> На самом деле, свободный цитозольного Ca 2+ , который функционирует как посланному на счетах сцепных ЕС для около 1% от общего внутриклеточного Са 2+ и большинство Са 2+ связывается с внутриклеточными Ca 2+ буфера 5,6. Это связано с тем , что различные Са 2+ буферы в изобилии в кардиомиоциты, например, мембранные фосфолипиды, АТФ, креатинфосфата, кальмодулин, парвальбумина, миофибрилла TnC, миозин, SERCA2a и calsequestrin в СР. 5.6.7. Среди них, SERCA2a и TnC являются преобладающими Са 2+ буферов 5,6,7. Кроме того, связывание Са 2+ с его буферами представляет собой динамический процесс во время подергивания (например, 30-50% Са 2+ связывается с TnC и отмежеваться от него во время Са 2+ 7) и изменения в Ca 2+ связывания причиной дополнительного "освобождение" свободного Са 2+ в цитозоле, приводит к переделок внутриклеточного Са 2+ концentration. Следовательно, возмущение внутриклеточного уровня Са 2+ вызывает аномальные движения myofilament, которые являются предшественниками сократительной дисфункции и аритмий 8,9. Многие факторы (как физиологические и патологические) могут быть источниками посттранскрипционных модификаций myofilament белков, которые влияют на myofilament Са 2+ буферизация и myofilament Ca 2+ чувствительности 8-10. Недавно было сообщено о том, что мутации в myofilament белки увеличивают Са 2+ сродство связывания и внутриклеточного обработку Ca 2+, вызывая паузы зависящих от потенцирование Ca 2+, Ca 2+ ненормальным релиз и аритмий 8. В соответствии с этой концепцией, мы также показали , что myofilament Ca 2+ десенсибилизации в гипертоников сердцах крыс вторичным по отношению к регуляцию нейрональной синтазы оксида азота связан с повышенным уровнем диастолического и систолического Ca 2+ уровней11, который , в свою очередь, повышает уязвимость к LTCC Ca 2+ -зависимые инактивация 12. Следовательно, myofilament Ca 2+ чувствительность является "активным" регулятором внутриклеточного Ca 2+ гомеостаза и сократительной функции кардиомиоцитов. Стало необходимо проанализировать взаимодействие между myofilament и Ca 2+ обработка белков для тщательного изучения миоцитов сцепления EC и сердечной функции.Здесь мы опишем протокол , который оценивает изменения myofilament Ca 2+ чувствительности в изолированных кардиомиоцитов. Комплексный анализ внутриклеточного Ca 2+ профиль, myofilament Ca 2+ чувствительность и сжатие будет раскопать романа механизмы , лежащие в миокарде механики.
Здесь мы описываем протоколы для оценки изменений myofilament Ca 2+ чувствительности в одной изолированной сердечной миоцита и подчеркнуть важность измерения этого параметра наряду с электрофизиологических свойств, внутриклеточный Ca 2+, и динамику myofilament. Это происходит потому, ч…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано Основном программой исследования науки через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемой Министерством образования, науки и техники (2013068067); выпускница программы Brain Korea 21 Министерства образования, науки и техники, Сеульский национальный госпиталь университета, Корейского общества гипертонии (2013 г.), исследовательского фонда SK Telecom корейской (нет. 3420130290), а также из Национального фонда естественных наук Китая (NSFC 31460265; NSFC 81260035).
Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
NaCl | Sigma | S9625 | |
KCl | Sigma | P4504 | |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
Mannitol | Sigma | M4125 | |
MgSO4 | Sigma | M5921 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
Protease | Sigma | P6911 | |
Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
MyoCam-S Power | IonOptix | ||
Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
CFA300 | |||
PMT400 | |||
Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
Compositions of Experimental Solutions | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
Collangenase Solution 1 | |||
Isolation Solution (30mL) | |||
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
Collangenase Solution 2 | |||
Isolation Solution (20mL) | |||
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
BSA solution | |||
Isolation Solution (40mL) | |||
Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |