筋フィラメントのCaの評価²⁺感度基礎心臓興奮収縮連関

Summary

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Abstract

心不全や不整脈は、世界中の死亡率および罹患率の主要な原因です。しかし、疾患のある心臓における病因および心筋機能不全のメカニズムは完全には明らかにされないままです。最近の説得力のある証拠は、筋フィラメントの変化は、Ca ²⁺感度心筋細胞における細胞内Ca ²⁺恒常性およびイオンチャネルの活動に影響を及ぼしていること健康と病気の心の中で心臓の活動電位と収縮を担う不可欠なメカニズムを示しています。実際、心臓の活動電位の基礎となるイオンチャネルやトランスポーターの活動（ 例えば Na ^{+、 の} Ca ²⁺およびK ⁺チャネルおよびNa ⁺ -Ca ²⁺交換体）と細胞内Ca ²⁺のタンパク質（ 例えば 、リアノジン受容体およびCaの取り扱い筋小胞体（SERCA2aの）またはホスホランバンおよびそのリン酸化^）2+ -ATPaseは、従来evaluするために測定されます心臓の興奮収縮（EC）カップリングの基本的なメカニズムを食べました。筋フィラメントが収縮と弛緩の機能単位であり、筋フィラメント^の Ca ²⁺感受性が筋原繊維性能の実装では不可欠であるのに対し、膜と細胞内Ca ²⁺変化の両方の電気的活動は、ECカップリングのトリガ信号です。それが研究の焦点でない限り、それにもかかわらず、いくつかの研究では、心筋の機能解析に筋フィラメントのCa ²⁺感受性を組み込みます。ここでは、サルコメア短縮/再延長とのFura-2 AM（レシオメトリック検出）およびラット心臓から心筋細胞における筋フィラメントのCa ²⁺感受性の変化を評価を使用して、細胞内Ca ²⁺レベルを測定プロトコルを記述します。主な目的は、筋フィラメントのCa ²⁺感受性が機構的な分析のためのECカップリングに考慮されるべきであることを強調することです。私の総合的な調査翻訳および治療 ​​的価値のより効果的な戦略を設計するための貴重な情報を提供する健康と病気の心の中で筋細胞の収縮性を根底チャネル、イオントランスポーター、細胞内Ca ²⁺の取り扱い、および筋フィラメント^の Ca ²⁺感受性に。

Introduction

心臓の興奮収縮（EC）カップリングは、心筋の機械的特性を分析するための基本的なスキーム、 すなわち、心臓^1,2の収縮機能です。 ECカップリングは、筋細胞膜のイオンチャネル（ 例えば、パッチクランプ技術によって測定することができる電位依存性^{Na +}チャネル）の活性に対する二次膜の脱分極によって開始されます。 LTCCs を経由して 、その後の電位依存性L型の活性化のCa ²⁺チャネル（LTCCs）およびCa ²⁺流入は、ナノモル（nMでから細胞質ゾルCa ²⁺濃度を増加させ、リアノジン受容体（RyRs）を介してのCa ²⁺放出の大部分をトリガ）（μM）レベルをマイクロモル。細胞質ゾル^の Ca ²⁺におけるこのような増加は、細いフィラメント中のトロポニンC（TnCの）へのCa ²⁺結合を促進し、誘発フィラメント複合体の立体構造変化をアクチン-ミオシン相互作用を容易にし、myocardiを達成しますアルは^3を収縮しました。逆に、細胞質ゾルCa ^2+が SR中のCa ²⁺ -ATPaseを介して筋小胞体（SR）（SERCA2aの）に戻し再取り込まれる又はNa ⁺ / ^の Ca ²⁺交換器と原形質膜を介して筋細胞の外に押し出され、 Ca ²⁺ ATPアーゼ^1,2。その結果、細胞質ゾルのCaの減少は²⁺アクチン-ミオシンと筋細胞弛緩^1-3の解離の結果、元の状態に戻し細いフィラメントの立体構造変化を扇動します。ほとんどの哺乳動物の心臓細胞における¹細胞質ゾルのCa ^2+の除去の90％ -それは70を占めるので、この方式では、SERCA2aの活性は、一般に、心筋弛緩の速度を決定すると考えられます。このように、などLTCC、のRyRとのSERCA2a、による異常のCa ²⁺ハンドリングが疾患のある心臓^1-4で損なわれた収縮と弛緩のための主要なメカニズムと考えられてきました。

<p class="jove_content">実際には^、2+総細胞内Caの約1％のECカップリング勘定のメッセンジャーおよびCa ²⁺の大部分として機能する細胞内Ca ²⁺バッファ^5,6にバインドされている無料のサイトゾル^の Ca ^2+。これは、様々なのCa ²⁺緩衝液は、 例えば、膜リン脂質、ATP、クレアチンリン酸、カルモジュリン、パルブアルブミン、筋原繊維のTnC、ミオシン、SERCA2aの、かつSRのカルセケストリン心筋細胞に豊富であるという事実にある^。5,6,7。これらの中でも、SERCA2aのとTnCのは、支配的なのCa ²⁺バッファ^5,6,7です。また、Caは^2+、そのバッファへの結合は単収縮時の動的なプロセスであり、追加の原因を結合のCa ²⁺の変化（ 例えば、Ca ^2+を 30〜50％が²⁺トランジェント⁷のTnCに結 ​​合し、カルシウムの間にそれから解離します）濃細胞内Ca ²⁺の変更で、細胞質ゾルに遊離Ca ²⁺の結果を「解放」entration。その結果、細胞内Ca ²⁺レベルの摂動は、収縮不全および不整脈^8,9の前駆体である異常な筋フィラメントの動きを誘導します。 （生理学的および病理学の両方）は、多くの要因が筋フィラメントのCa ²⁺バッファリングと筋フィラメントのCa ²⁺感受性^8-10に影響^を与える筋フィラメントタンパク質の転写後修飾の源とすることができます。最近では、のCa ²⁺トランジェント、異常のCa ²⁺放出、および不整脈⁸のポーズ依存増強を誘発、筋フィラメントタンパク質における突然変異は、Ca ²⁺結合親和性および細胞内Ca ²⁺ハンドリングを向上させることが報告されました。この考え方に沿って、我々はまた、神経型一酸化窒素合成酵素のアップレギュレーションに対する二次性高血圧ラット心臓における筋フィラメントのCa ²⁺の脱感作が上昇、拡張期と収縮期のCa ²⁺レベルに関連付けられていることが示されています今度は、のCa ²⁺依存性不活性化¹² LTCCの脆弱性を増加させる^11、。したがって、筋フィラメントのCa ²⁺感受性は、細胞内Ca ²⁺ホメオスタシスと筋細胞収縮機能の「アクティブ」な調節因子です。これは、筋フィラメントおよびCa ²⁺の間の相互作用、筋細胞、ECカップリング及び心臓機能の徹底的な調査のためのタンパク質の取り扱いを分析することが必要となってきています。

ここでは、孤立した心筋細胞における筋フィラメントのCa ²⁺感受性の変化を評価するプロトコルを記述します。細胞内Ca ²⁺プロファイル、筋フィラメントのCa ²⁺感受性および収縮の包括的な分析は、新規メカニズムを根底にある心筋の力学を発掘します。

Protocol

プロトコルは健康の国連国立研究所によって公開実験動物の管理と使用に関する指針に従っている（NIH公開番号85-23、1996年改訂）。これは、ソウル大学（IACUC承認番号：SNU-101213から1）の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。 1.バッファーの調製（表材料および装置） NaCl、135;のKCl、5.4;のMgCl 2、3.5;グルコース、5; HEPES、5;のNa 2<…

Representative Results

LV筋細胞は、正常と高血圧ラット心臓から単離されます。フィールドの刺激に応答して、明確な条線（サルコメアを表す）、安定した収縮との棒状筋細胞は、最適な筋細胞であると考えられていると録音（ 図2A）のために選択されています。 Fのigure 2Aに示す例では、フラ2 AMは、LV筋細胞が水平に配置され、筋細胞、記録フィールドの大部分?…

Discussion

ここでは、単一の孤立心筋細胞における筋フィラメントのCa ²⁺感受性の変化を評価し、電気生理学的特性、細胞内Ca ²⁺過渡電流、および筋フィラメント動態と一緒に、このパラメータを測定することの重要性を強調するためのプロトコルを記述します。パラメータの一つまたは二つの記録は、心臓の収縮と弛緩のメカニズムを解明しない場合があるからです。個別に¹?…

Materials

Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
		CFA300
		PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM