Tissue Engineering door Intrinsic Vascularisatie in een<em> In Vivo</em> Tissue Engineering Chamber
Summary
This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.
Abstract
In reconstructieve chirurgie, is een klinische behoefte aan een alternatief voor de huidige methoden van autologe reconstructie die ingewikkeld en duur en handel een defect voor een ander zijn. Tissue engineering houdt de belofte om deze toenemende vraag te pakken. Echter, de meeste tissue engineering strategieën falen om een stabiele en functionele weefsel vervangers vanwege de slechte vascularisatie te genereren. Dit artikel richt zich op een in vivo tissue engineering kamer model van de intrinsieke vascularisatie waarbij een perfusie slagader en een ader ofwel als een arterioveneuze lus of een flow-through uitloper configuratie is gericht in een beschermde holle kamer. In deze kamer-gebaseerde systeem optreedt angiogene ontspruit uit de arterioveneuze schepen en dit systeem trekt ischemische en inflammatoire gedreven endogeen celmigratie die geleidelijk vult de kamer ruimte met fibro-vasculair weefsel. Exogene cel / matrix implantatie ten tijde van de kamer bouw verbetert cel survival en bepaalt specificiteit van de gemanipuleerde weefsels die zich ontwikkelen. Onze studies hebben aangetoond dat deze kamer model succesvol genereren verschillende weefsels zoals vet, hartspier, lever en anderen. Echter, modificaties en verfijningen moeten doelweefsel vorming consistent en reproduceerbaar te waarborgen. Dit artikel beschrijft een gestandaardiseerd protocol voor de productie van twee verschillende gevasculariseerde weefselmanipulatie kamermodellen in vivo.
Introduction
Vervaardigen van functionele doorbloed weefsel met behulp van een tissue engineering aanpak is een opkomende paradigma in de regeneratieve geneeskunde. 1,2 Veel benaderingen van nieuwe en gezond weefsel ingenieur voor de vervanging van beschadigd weefsel of defecte organen zijn ontwikkeld, 3-6 experimenteel in kleine dierlijke modellen met veelbelovende klinische potentieel. 7,8 Toch vascularisatie blijft een van de grote uitdagingen voor de tissue engineering beperken van de mogelijkheden om weefsels van klinisch relevante omvang groeien. 9
De huidige aanpak om weefsel vascularizeren volgen ofwel een extrinsieke route waar nieuwe schepen groeien vanuit de ontvanger vasculaire bed en binnen te dringen in de hele geïmplanteerde weefsel construeert 10 of een intrinsieke vascularisatie route, waar het vaatstelsel groeit en breidt uit in harmonie met de nieuw te ontwikkelen weefsel. 11 De extrinsieke benadering traditioneel omvat zaaien cellen op een steigerin vitro en implanteren van de volledige construct in het levende dier met de verwachting dat voedingsstoffen, eerder door kweekmedia geleverd, wordt aangeleverd door circulatie. 12,13 Het concept is simpel vasculaire ingroei te langzaam en slechts zeer dunne implantaten (< 1-2 mm dik) zal levensvatbaar blijven. Verschaffen van voedingsstoffen en zuurstof door middel van een voldoende snelle en vascularisatie is de kern van elke succesvolle pogingen om complexere en grotere weefselengineering substituten zoals bot, spier, vet en vaste organen groeien. 14,15 Intrinsieke vascularisatie sector stelt grotere constructies te ontwikkelen door progressieve groei van weefsel in verhouding met zijn uitbreiden bloedtoevoer. Een ontwerp is de in vivo implantatie in een kamer van een vaatsteel met of zonder cellen geënte scaffold. 5,6 Dit heeft de weg naar nieuwe procedures voor het genereren van dikkere intrinsiek gevasculariseerde weefsels vrijgemaakt. 16,17 </ P>
Recenter hebben strategieën ontwikkeld om vooraf vasculariseren weefseltransplantaten, vóór implantatie. Deze opgenomen bloedvat netwerken zijn erop gericht om te doen vergroeien met de ontvangende schepen op implantatie waardoor de snelle levering van een compleet bloedtoevoer naar de overleving van alle onderdelen van een getransplanteerd dikke weefsel graft te verbeteren. 18
We zijn voorlopers een in vivo doorbloed tissue engineering model in kleine dieren die een subcutaan geïmplanteerd halfharde omsloten ruimte met daarin een perfusie vaatsteel en-cel met biomaterialen gaat. De kamer creëert een ischemische omgeving die angiogene ontspruit uit de geïmplanteerde vaten stimuleert. 3 De vaatsteel kan ofwel een gereconstrueerd arterioveneuze lus of een intacte doorstroming slagader en ader zijn. 3-6,19 Deze vaatsteel spruiten een goed functionerende en uitgebreide arterio -capillary-veneuze netwerk dat verbindt aan beide arteriole en veneuze eindigt met de vaatsteel. 3,20 Bovendien, de omliggende holle hulpkamer beschermt de ontwikkeling van weefsel van potentieel vervormen mechanische krachten en verlengt de ischemische drive om vascularisatie te verbeteren. 3,21,22 Als het schip uitloper eenvoudig in is geïmplanteerd normaal weefsel en niet in de beschermde ruimte van de kamer, angiogenese houdt langs dezelfde tijdlijn als een normale wond en geen nieuw weefsel ophopen rond de pedikel. Onderzoekers hebben deze in vivo configuratie gebruikt om driedimensionale functionele gevasculariseerde weefselconstructen met ondersteunende vasculatuur en klinisch relevante afmetingen produceren. 4,23 Voorts gevasculariseerde de gemanipuleerde weefselconstructen met intacte vaatsteel kunnen worden geoogst voor latere transplantatie in de beschadigde plaats . 24,25 Een klinisch haalbaar scenario zou zijn het creëren van de kamer bij de definitieve locatie voor de wederopbouw such de borst. Aldus zou het de novo tissue engineering aanpak klinische potentie om een nieuwe bron van functionele doelweefsel voor reconstructieve chirurgie hebben. 26-28
Het volgende protocol wordt een algemene handleiding een in vivo gevasculariseerde weefselmanipulatie kamer construct in de rat, die kunnen worden aangepast in verschillende diermodellen en toegepast om de complexe processen van angiogenese, matrixproductie, en cellulaire migratie en differentiatie te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Engineering van de microcirculatie wordt momenteel hoofdzakelijk wordt onderzocht door middel van twee benaderingen. De eerste omvat de ontwikkeling van een sterk onderling verbonden vasculaire netwerk binnen het construct in vitro zodat wanneer geïmplanteerd, capillairen van de gastheer vaatbed verbinden met die van de getransplanteerde construeren door een proces genaamd inoculatie, waardoor de levering van voedingsstoffen niet alleen de omtrek maar ook de kern. 21,32,33 Dit wordt pre-vascularisat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van NHMRC en Stafford Fox Medical Foundation. De auteurs erkennen de chirurgische hulp van Sue McKay, Liliana Pepe, Anna Deftereos en Amanda Rixon van de experimentele medische en chirurgische Unit, St. Vincent's Hospital, Melbourne. Ondersteuning wordt ook verstrekt door Ministerie van innovatie, industrie de Victoriaanse staat regering en de operationele infrastructuur Support Program voor Regionale Ontwikkeling.
Materials
| 1 15 Blade Scalpel | Braun | BB515 | |
| 1 Toothed Adson Forceps | Braun | BD527R | |
| 1 Needle Holder | Braun | BM201R | |
| 1 Bipolar Coagulator | Braun | US335 | |
| 1 Micro Needle Holder B-15-8.3 | S & T | 00763 | |
| 1 Micro Dilator Forceps D-5a.2 | S & T | 00125 | |
| 1 Micro Jeweler's Forceps JF-5 | S & T | 00108 | |
| 1 Micro Scissors – Straight SAS-11 | S & T | 00098 | |
| 1 Micro Scissors – Curved SDC-11 | S & T | 00090 | |
| 2 Single Clamps B-3 | S & T | 00400 | |
| 2 10/0 nylon suture | S & T | 03199 | |
| 1 6/0 nylon suture | Braun | G2095469 | |
| 2 4/0 Silk Sutures | Braun | C0760145 | |
| Xilocaine 1% | Dealmed | 150733 | 10 mg/ml |
| Heparin Sodium | Dealmed | 272301 | 5000 UI / ml |
| Ringer Lactate | Baxter | JB2323 | 500 ml |
| 1 dome-shaped tissue engineering chamber | custom made | ||
| 1 flow-through chamber | custom made | ||
| Lectin I, Griffonia Simplicifolia | Vector Laboratories | B-1105 | 1.67 μg/mL |
| Troponin T antibody | Abcam | Ab8295 | 4 μg/mL |
| Human-specific Ku80 antibody | Abcam | Ab80592 | 0.06 μg/mL |
| Desmin antibody | Dako | M0760 | 2.55 μg/mL |
| Cell Tracker CM-DiI dye | Thermo Fisher Scientific | C-7000 | 3 mg/106 cells |
Riferimenti
- Spiliopoulos, K., et al. Current status of mechanical circulatory support: A systematic review. Cardiol Res Pract. , 574198 (2012).
- Hsu, P. L., Parker, J., Egger, C., Autschbach, R., Schmitz-Rode, T., Steinseifer, U. Mechanical circulatory support for right heart failure: Current technology and future outlook. Artif Organs. 36 (4), 332-347 (2012).
- Lokmic, Z., Stillaert, F., Morrison, W. A., Thompson, E. W., Mitchell, G. M. An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent, highly vascular, tissue-engineered construct. FASEB J. 21 (2), 511-522 (2007).
- Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).
- Tanaka, Y., Tsutsumi, A., Crowe, D. M., Tajima, S., Morrison, W. A. Generation of an autologous tissue (matrix) flap by combining an arteriovenous shunt loop with artificial skin in rats: preliminary report. B J Plast Surg. 53 (1), 51-57 (2000).
- Cronin, K. J., et al. New murine model of spontaneous autologous tissue engineering, combining an arteriovenous pedicle with matrix materials. Plast Reconstr Surg. 113 (1), 260-269 (2004).
- Forster, N. A., et al. A prevascularized tissue engineering chamber supports growth and function of islets and progenitor cells in diabetic mice. Islets. 3 (5), 271-283 (2011).
- Choi, Y. S., Matsuda, K., Dusting, G. J., Morrison, W. A., Dilley, R. J. Engineering cardiac tissue in vivo from human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (8), 2236-2242 (2010).
- Jeyaraj, R., G, N., Kirby, G., Rajadas, J., Mosahebi, A., Seifalian, A. M., Tan, A. Vascularisation in regenerative therapeutics and surgery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 54, 225-238 (2015).
- Dew, L., Macneil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
- Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
- Vacanti, J. P., Langer, R., Upton, J., Marler, J. J. Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 33 (1-2), 165-182 (1998).
- Beahm, E. K., Walton, R. L., Patrick, C. W. Progress in adipose tissue construct development. Clin Plast Surg. 30 (4), 547-558 (2003).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 169-187 (2010).
- Garcia, J. R., Garcia, A. J. Biomaterial-mediated strategies targeting vascularization for bone repair. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Forster, N., et al. Expansion and hepatocytic differentiation of liver progenitor cells in vivo using a vascularized tissue engineering chamber in mice. Tissue Eng Part C Methods. 17 (3), 359-366 (2011).
- Tilkorn, D. J., et al. Implanted myoblast survival is dependent on the degree of vascularization in a novel delayed implantation/prevascularization tissue engineering model. Tissue Eng Part A. 16 (1), 165-178 (2010).
- Chang, Q., Lu, F. A novel strategy for creating a large amount of engineered fat tissue with an axial vascular pedicle and a prefabricated scaffold. Med hypotheses. 79 (2), 267-270 (2012).
- Walton, R. L., Beahm, E. K., Wu, L. De novo adipose formation in a vascularized engineered construct. Microsurg. 24 (5), 378-384 (2004).
- Debels, H., Gerrand, Y. W., Poon, C. J., Abberton, K. M., Morrison, W. A., Mitchell, G. M. An adipogenic gel for surgical reconstruction of the subcutaneous fat layer in a rat model. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 87-103 (2008).
- Yap, K. K., et al. Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber. Biomaterials. 34 (16), 3992-4001 (2013).
- Findlay, M. W., et al. Tissue-engineered breast reconstruction: Bridging the gap toward large-volume tissue engineering in humans. Plast Reconstr Surg. 128 (6), 1206-1215 (2011).
- Tee, R., Morrison, W. A., Dusting, G. J., Liu, G. S., Choi, Y. S., Hsiao, S. T., Dilley, R. J. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 1992-1999 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Long-term stability of adipose tissue generated from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2283-2292 (2011).
- Sekine, H., et al. Endothelial cell coculture within tissue-engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts. Circulation. 118, 145-152 (2008).
- Ting, A. C., et al. The adipogenic potential of various extracellular matrices under the influence of an angiogenic growth factor combination in a mouse tissue engineering chamber. Acta Biomater. 10 (5), 1907-1918 (2014).
- Zhan, W., et al. Self-synthesized extracellular matrix contributes to mature adipose tissue regeneration in a tissue engineering chamber. Wound Repair Regen. 23 (3), 443-452 (2015).
- Messina, A., Bortolotto, S. K., Cassell, O. C., Kelly, J., Abberton, K. M., Morrison, W. A. Generation of a vascularized organoid using skeletal muscle as the inductive source. FASEB J. 19 (11), 1570-1572 (2005).
- Lim, S. Y., Hernández, D., Dusting, G. J. Growing vascularized heart tissue from stem cells. J Cardiovasc Pharmacol. 62 (2), 122-129 (2013).
- Poon, C. J., et al. Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue. Acta Biomater. 9 (3), 5609-5620 (2013).
- Dilley, R. J., Morrison, W. A. Vascularisation to improve translational potential of tissue engineering systems for cardiac repair. Int J Biochem Cell Biol. 56, 38-46 (2014).
- Lesman, A., Koffler, J., Atlas, R., Blinder, Y. J., Kam, Z., Levenberg, S. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Hussey, A. J., et al. Seeding of pancreatic islets into prevascularized tissue engineering chambers. Tissue Eng Part A. 15 (12), 3823-3833 (2009).
- Chen, X., Aledia, A. S., Popson, S. A., Him, L., Hughes, C. C., George, S. C. Rapid anastomosis of endothelial progenitor cell-derived vessels with host vasculature is promoted by a high density of cotransplanted fibroblasts. Tissue Eng Part A. 16 (2), 585-594 (2010).
- Lin, R. Z., Melero-Martin, J. M. Fibroblast growth factor-2 facilitates rapid anastomosis formation between bioengineered human vascular networks and living vasculature. Methods. 56 (3), 440-451 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Spontaneous large volume adipose tissue generation from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber space. Tissue Eng. 13 (4), 673-681 (2007).
- Wei, F. C., Lin Tay, S. K., Neligan, P. C., Gurtner, G. C. Principles and techniques of microvascular surgery. Plastic Surgery. Volume 1. , 587-620 (2013).
- Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat.Comm. 4 (1399), 1-10 (2013).
- Lim, S. Y., Sivakumaran, P., Crombie, D. E., Dusting, G. J., Pébay, A., Dilley, R. J. Trichostatin A enhances differentiation of human induced pluripotent stem cells to cardiogenic cells for cardiac tissue engineering. Stem Cells Transl Med. 2 (9), 715-725 (2013).
- Lim, S. Y., et al. In vivo tissue engineering chamber supports human induced pluripotent stem cell survival and rapid differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 422 (1), 75-79 (2012).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 787-791 (2014).
