Тканевая инженерия по искробезопасности васкуляризации<em> В Vivo</em> Tissue Engineering палата
Summary
This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.
Abstract
В реконструктивной хирургии, существует клиническая необходимость альтернативы нынешним методам аутогенной реконструкции, которые являются сложными, дорогостоящими и торговли один недостаток для другого. Тканевая инженерия держит обещание для решения этого растущего спроса. Тем не менее, большинство тканевой инженерии стратегии не генерировать стабильные и функциональные заменители тканей из-за плохой васкуляризации. Эта статья фокусируется на в естественных условиях тканевой инженерии камерной модели внутренней васкуляризации , где перфузировались артерии и вены либо как петли артериовенозной или конфигурации педикулярного проточного направляется внутри защищенной полой камеры. В этой камере на основе системы ангиогенеза происходит из артериовенозных сосудов и эта система привлекает ишемический и воспалительный приводом эндогенный миграцию клеток, которая постепенно заполняет камеру пространство с фиброзно-сосудистой ткани. Экзогенный клеток / матрица имплантации во время строительства камеры усиливает клеточную Сюрvival и определяет специфику инженерно-технических тканей, которые развиваются. Наши исследования показали, что эта камера модель может успешно генерировать различные ткани, такие как жир, сердечной мышцы, печени и других. Тем не менее, изменения и уточнения необходимы для обеспечения ткани-мишени образование последовательна и воспроизводимым. В данной статье описывается стандартизированный протокол для изготовления двух различных моделей васкуляризированных тканевой инженерии камеры в естественных условиях.
Introduction
Перерабатывающие функциональной васкуляризированных ткани с использованием тканевой инженерии подход является новой парадигмой в регенеративной медицине. 1,2 Многие подходы для конструирования новой и здоровой ткани для замены поврежденной ткани или дефектных органов были разработаны, 3-6 экспериментально в небольших животных моделей с многообещающий клинический потенциал. 7,8 Однако, васкуляризация остается одной из самых больших проблем для тканевой инженерии , ограничивающих ее потенциал для роста тканей клинически значимого размера. 9
Современные подходы к vascularize ткани следуют либо внешний путь , где новые сосуды растут от реципиента сосудистого русла и вторгнуться на протяжении всего имплантированный ткани создает 10 или внутреннюю васкуляризации путь , где васкулатура растет и расширяется в унисон с вновь развивающейся ткани. 11 Внешняя подход традиционно включает в себя высева клеток на эшафотв пробирке и имплантация полную конструкцию в живом организме животного с ожиданием того, что питательные вещества, ранее предоставленной культуральной среды, будут получены из обращения. 12,13 Концепция упрощенно , как сосудистая врастание происходит слишком медленно , и только очень тонкие имплантаты (< толщиной 1-2 мм) остаются жизнеспособными. Обеспечение питательных веществ и кислорода при помощи достаточного и быстрого васкуляризации лежит в основе каких – либо успешных попыток становятся все более сложными и более крупные тканевой инженерии заменители , такие как кости, мышцы, жир и солидных органов. 14,15 искробезопасности васкуляризация предлагает потенциал более крупные конструкции для развития путем роста прогрессивной ткани, соизмеримых с ее расширяющейся кровоснабжения. Один дизайн имплантации в естественных условиях в камере сосудистой ножке с или без затравки эшафот клеток. 5,6 Это открыло путь к новым процедурам для генерации более толстых внутренне васкуляризированных тканей. 16,17 </ Р>
В последнее время были разработаны стратегии для предварительного vascularize трансплантатов ткани, до имплантации. Эти объединенные сети кровеносных сосудов направлены на срастаться с принимающими судами при имплантации позволяет обеспечить быстрое предоставление полного снабжения кровью , чтобы улучшить выживание всех частей пересаженного трансплантата толстой ткани. 18
Мы впервые в естественных условиях васкуляризированных тканевой инженерии модель в мелких животных , которая включает подкожно имплантировали полужесткий закрытую камеру , содержащую перфузии сосудистую ножку и клеток , содержащих биоматериалов. Камера создает ишемический среду , которая стимулирует ангиогенеза из имплантированных сосудов. 3 сосудистая ножка может быть либо реконструированный петлю артериовенозной или проточный артерии и вены нетронутыми. 3-6,19 This сосудистая ножка рассаду функционирующей и обширная артерио -capillary-венозная сеть, которая связывает в обоих искусстваeriole и венозная заканчивается сосудистой ножке. 3,20 Кроме того, окружающие полые опорные камеры защищает развивающиеся ткани от потенциально деформирующего механические силы и увеличивает ишемические стремление повысить васкуляризации. 3,21,22 Если ножка судно просто имплантировать в нормальная ткань, а не внутри защищаемого пространства камеры, ангиогенеза прекращается по той же шкале, как и обычная рана и без новой ткани будет аккумулировать вокруг ножке. Исследователи использовали эту конфигурацию в естественных условиях для получения трехмерных функциональных конструкций васкуляризирована ткани с поддерживающей сосудистую сеть и клинически значимого размера. 4,23 Кроме того, сконструированные конструкции васкуляризирована ткани с ее неповрежденной сосудистой ножке можно собирать для последующей трансплантации в месте повреждения . 24,25 более клинически осуществимо сценарий будет создание камеры на месте окончательной реконструкции sуч как грудь. Таким образом, De Novo тканевой инженерии подход может иметь клинический потенциал , чтобы обеспечить новый источник функциональной ткани – мишени для реконструктивной хирургии. 26-28
Следующий протокол обеспечит общее руководство для построения васкуляризированных тканевой инженерии камеры в естественных условиях на крысах, которые могут быть адаптированы в различных животных моделях и используемых для изучения сложных процессов ангиогенеза, производства матрицы и клеточной миграции и дифференцировки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Проектирование микроциркуляции в настоящее время исследуется главным образом с помощью двух подходов. Первый включает в себя разработку высоко взаимосвязанную сосудистую сеть внутри конструкции в пробирке , так что при имплантации, капилляры от хозяина сосудистого русла соедин…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была выполнена при поддержке гранта финансирование из NHMRC и Стаффорд Fox Medical Foundation. Авторы признают хирургической помощи Сью Маккей, Лилиана Пепе, Анна Deftereos и Аманда Риксон опытной медико-хирургического отделения, больницы Сент-Винсент, Мельбурн. Поддержка также обеспечивается Департаментом штата Виктория правительства инноваций, промышленности и Операционной программы Инфраструктура поддержки региональному развитию.
Materials
| 1 15 Blade Scalpel | Braun | BB515 | |
| 1 Toothed Adson Forceps | Braun | BD527R | |
| 1 Needle Holder | Braun | BM201R | |
| 1 Bipolar Coagulator | Braun | US335 | |
| 1 Micro Needle Holder B-15-8.3 | S & T | 00763 | |
| 1 Micro Dilator Forceps D-5a.2 | S & T | 00125 | |
| 1 Micro Jeweler's Forceps JF-5 | S & T | 00108 | |
| 1 Micro Scissors – Straight SAS-11 | S & T | 00098 | |
| 1 Micro Scissors – Curved SDC-11 | S & T | 00090 | |
| 2 Single Clamps B-3 | S & T | 00400 | |
| 2 10/0 nylon suture | S & T | 03199 | |
| 1 6/0 nylon suture | Braun | G2095469 | |
| 2 4/0 Silk Sutures | Braun | C0760145 | |
| Xilocaine 1% | Dealmed | 150733 | 10 mg/ml |
| Heparin Sodium | Dealmed | 272301 | 5000 UI / ml |
| Ringer Lactate | Baxter | JB2323 | 500 ml |
| 1 dome-shaped tissue engineering chamber | custom made | ||
| 1 flow-through chamber | custom made | ||
| Lectin I, Griffonia Simplicifolia | Vector Laboratories | B-1105 | 1.67 μg/mL |
| Troponin T antibody | Abcam | Ab8295 | 4 μg/mL |
| Human-specific Ku80 antibody | Abcam | Ab80592 | 0.06 μg/mL |
| Desmin antibody | Dako | M0760 | 2.55 μg/mL |
| Cell Tracker CM-DiI dye | Thermo Fisher Scientific | C-7000 | 3 mg/106 cells |
Riferimenti
- Spiliopoulos, K., et al. Current status of mechanical circulatory support: A systematic review. Cardiol Res Pract. , 574198 (2012).
- Hsu, P. L., Parker, J., Egger, C., Autschbach, R., Schmitz-Rode, T., Steinseifer, U. Mechanical circulatory support for right heart failure: Current technology and future outlook. Artif Organs. 36 (4), 332-347 (2012).
- Lokmic, Z., Stillaert, F., Morrison, W. A., Thompson, E. W., Mitchell, G. M. An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent, highly vascular, tissue-engineered construct. FASEB J. 21 (2), 511-522 (2007).
- Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).
- Tanaka, Y., Tsutsumi, A., Crowe, D. M., Tajima, S., Morrison, W. A. Generation of an autologous tissue (matrix) flap by combining an arteriovenous shunt loop with artificial skin in rats: preliminary report. B J Plast Surg. 53 (1), 51-57 (2000).
- Cronin, K. J., et al. New murine model of spontaneous autologous tissue engineering, combining an arteriovenous pedicle with matrix materials. Plast Reconstr Surg. 113 (1), 260-269 (2004).
- Forster, N. A., et al. A prevascularized tissue engineering chamber supports growth and function of islets and progenitor cells in diabetic mice. Islets. 3 (5), 271-283 (2011).
- Choi, Y. S., Matsuda, K., Dusting, G. J., Morrison, W. A., Dilley, R. J. Engineering cardiac tissue in vivo from human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (8), 2236-2242 (2010).
- Jeyaraj, R., G, N., Kirby, G., Rajadas, J., Mosahebi, A., Seifalian, A. M., Tan, A. Vascularisation in regenerative therapeutics and surgery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 54, 225-238 (2015).
- Dew, L., Macneil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
- Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
- Vacanti, J. P., Langer, R., Upton, J., Marler, J. J. Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 33 (1-2), 165-182 (1998).
- Beahm, E. K., Walton, R. L., Patrick, C. W. Progress in adipose tissue construct development. Clin Plast Surg. 30 (4), 547-558 (2003).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 169-187 (2010).
- Garcia, J. R., Garcia, A. J. Biomaterial-mediated strategies targeting vascularization for bone repair. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Forster, N., et al. Expansion and hepatocytic differentiation of liver progenitor cells in vivo using a vascularized tissue engineering chamber in mice. Tissue Eng Part C Methods. 17 (3), 359-366 (2011).
- Tilkorn, D. J., et al. Implanted myoblast survival is dependent on the degree of vascularization in a novel delayed implantation/prevascularization tissue engineering model. Tissue Eng Part A. 16 (1), 165-178 (2010).
- Chang, Q., Lu, F. A novel strategy for creating a large amount of engineered fat tissue with an axial vascular pedicle and a prefabricated scaffold. Med hypotheses. 79 (2), 267-270 (2012).
- Walton, R. L., Beahm, E. K., Wu, L. De novo adipose formation in a vascularized engineered construct. Microsurg. 24 (5), 378-384 (2004).
- Debels, H., Gerrand, Y. W., Poon, C. J., Abberton, K. M., Morrison, W. A., Mitchell, G. M. An adipogenic gel for surgical reconstruction of the subcutaneous fat layer in a rat model. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 87-103 (2008).
- Yap, K. K., et al. Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber. Biomaterials. 34 (16), 3992-4001 (2013).
- Findlay, M. W., et al. Tissue-engineered breast reconstruction: Bridging the gap toward large-volume tissue engineering in humans. Plast Reconstr Surg. 128 (6), 1206-1215 (2011).
- Tee, R., Morrison, W. A., Dusting, G. J., Liu, G. S., Choi, Y. S., Hsiao, S. T., Dilley, R. J. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 1992-1999 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Long-term stability of adipose tissue generated from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2283-2292 (2011).
- Sekine, H., et al. Endothelial cell coculture within tissue-engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts. Circulation. 118, 145-152 (2008).
- Ting, A. C., et al. The adipogenic potential of various extracellular matrices under the influence of an angiogenic growth factor combination in a mouse tissue engineering chamber. Acta Biomater. 10 (5), 1907-1918 (2014).
- Zhan, W., et al. Self-synthesized extracellular matrix contributes to mature adipose tissue regeneration in a tissue engineering chamber. Wound Repair Regen. 23 (3), 443-452 (2015).
- Messina, A., Bortolotto, S. K., Cassell, O. C., Kelly, J., Abberton, K. M., Morrison, W. A. Generation of a vascularized organoid using skeletal muscle as the inductive source. FASEB J. 19 (11), 1570-1572 (2005).
- Lim, S. Y., Hernández, D., Dusting, G. J. Growing vascularized heart tissue from stem cells. J Cardiovasc Pharmacol. 62 (2), 122-129 (2013).
- Poon, C. J., et al. Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue. Acta Biomater. 9 (3), 5609-5620 (2013).
- Dilley, R. J., Morrison, W. A. Vascularisation to improve translational potential of tissue engineering systems for cardiac repair. Int J Biochem Cell Biol. 56, 38-46 (2014).
- Lesman, A., Koffler, J., Atlas, R., Blinder, Y. J., Kam, Z., Levenberg, S. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Hussey, A. J., et al. Seeding of pancreatic islets into prevascularized tissue engineering chambers. Tissue Eng Part A. 15 (12), 3823-3833 (2009).
- Chen, X., Aledia, A. S., Popson, S. A., Him, L., Hughes, C. C., George, S. C. Rapid anastomosis of endothelial progenitor cell-derived vessels with host vasculature is promoted by a high density of cotransplanted fibroblasts. Tissue Eng Part A. 16 (2), 585-594 (2010).
- Lin, R. Z., Melero-Martin, J. M. Fibroblast growth factor-2 facilitates rapid anastomosis formation between bioengineered human vascular networks and living vasculature. Methods. 56 (3), 440-451 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Spontaneous large volume adipose tissue generation from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber space. Tissue Eng. 13 (4), 673-681 (2007).
- Wei, F. C., Lin Tay, S. K., Neligan, P. C., Gurtner, G. C. Principles and techniques of microvascular surgery. Plastic Surgery. Volume 1. , 587-620 (2013).
- Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat.Comm. 4 (1399), 1-10 (2013).
- Lim, S. Y., Sivakumaran, P., Crombie, D. E., Dusting, G. J., Pébay, A., Dilley, R. J. Trichostatin A enhances differentiation of human induced pluripotent stem cells to cardiogenic cells for cardiac tissue engineering. Stem Cells Transl Med. 2 (9), 715-725 (2013).
- Lim, S. Y., et al. In vivo tissue engineering chamber supports human induced pluripotent stem cell survival and rapid differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 422 (1), 75-79 (2012).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 787-791 (2014).
