הנדסת רקמות ידי עצמותי כלי דם בתוך<em> In vivo</em> הנדסת רקמות קאמרית
Summary
This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.
Abstract
ב ניתוח שחזור, יש צורך רפואי אלטרנטיבת השיטות הקיימות של שחזור אוטולוגי שהן מורכבות, יקרים פגם סחר אחת באחרת. הנדסת רקמות ולפוטנציאל להתייחס הביקוש הגובר הזה. עם זאת, רוב אסטרטגיות הנדסת הרקמות תצלחנה לייצר תחליפי רקמות יציבים פונקציונליים בגלל כלי דם עניים. מאמר זה מתמקד מודל קאמרי הנדסת in vivo רקמה של כלי דם הפנימיים שבו עורק perfused וריד או כפי בלופ arteriovenous או תצורת pedicle זרימת דרך מופנה בתוך חדר חלול מוגן. במערכת תא מבוסס זה הנבטת angiogenic מתרחשת מכלי arteriovenous ומערכת המושך מונע איסכמית דלקתי נדידת תאי אנדוגני אשר ממלאת את החלל הקאמרי בהדרגה עם רקמת פיברו-וסקולרית. תא אקסוגניים / השתלת מטריקס בעת הבנייה קאמרית משפרת sur תאvival וקובע הספציפיות של רקמות מהונדסות אשר לפתח. המחקרים שלנו הראו כי מודל תא זה יכול ליצור שונים ברקמות בהצלחה כגון שומן, שריר לב, כבד ועוד. עם זאת, שינויים וחידודים נדרשים על מנת להבטיח רקמות יעד ההיווצרות היא עקבית לשחזור. מאמר זה מתאר פרוטוקול סטנדרטי עבור הייצור של שני מודלים קאמרי הנדסת רקמות כלי דם שונים in vivo.
Introduction
בודה רקמות כלי דם תפקודיות באמצעות גישת הנדסת רקמות הוא פרדיגמה המתעורר ברפואה רגנרטיבית. 1,2 גישות רבות להנדס רקמה חדשה ובריאה להחלפת רקמות פגועות או איברים פגומים פותח, 3-6 בניסוי במודלים של בעלי חיים קטנים עם פוטנציאל קליני מבטיח. 7,8 עם זאת, כלי הדם נשאר אחד האתגרים הגדולים עבור הנדסת רקמות הגבלת הפוטנציאל שלה לגדול רקמות בגודל משמעות קלינית. 9
גישות שוטפות vascularize רקמות אחרי או לא ודאית חיצוניים שבו כלי דם חדשים לגדול ממיטת הנמען וסקולרית ולפלוש ברחבי הרקמה המושתלת בונת 10 או מסלול כלי דם פנימי שבו כלי הדם גדל ומרחיבה ביחד עם הרקמות בפיתוח החדשה. 11 הגישה החיצונית באופן מסורתי כרוך תאי זריעה על פיגוםבמבחנה להשתיל את המבנה השלם לתוך החי מתוך הציפייה כי חומרים מזינים, שסופקו בעבר על ידי תקשורת ותרבות, יהיה שמקורו מן במחזור. 12,13 הרעיון הוא פשטני כפי ingrowth וסקולרית הוא איטי מדי ורק שתלים דקים מאוד (< 1-2 מ"מ עובי) יישאר קיימא. מתן חומרי מזון וחמצן באמצעות כלי דם מספיק ומהירים נמצאת בליבה של ניסיונות מוצלחים בכל לגדול יותר מורכבים ויותר תחליפי רקמות מהונדסות כגון עצמות, שרירים, שומן ואיברים מוצקים. 14,15 כלי דם פנימי מציע פוטנציאל בונה גדולה לפתח ידי גידול רקמות מתקדם בקנה אחד עם אספקת דם ההרחבה שלה. עיצוב אחת מהן היא השתלת in vivo לתוך תא של pedicle וסקולרית עם או בלי פיגום תא זרע. 5,6 זה סלל את הדרך נהלים חדשים עבור הדור של רקמות כלי דם עבה מיסודם. 16,17 </ P>
לאחרונה, פותחו אסטרטגיות טרום vascularize שתלי רקמה, לפני ההשתלה. רשתות כלי דם משולבים אלה מכוונות inosculate עם כלי מארח בהשרשה המאפשר למתן המהיר של אספקת דם מלאה כדי לשפר את ההישרדות של כל החלקים של שתל רקמה עבה מושתלת. 18
אנחנו חלוצים מודל הנדסת רקמות in vivo vascularized בחיות קטנות המערב בתא סגור חצי קשיח מושתל מתחת לעור המכיל pedicle וסקולרית perfused וחומרים ביולוגי תא המכיל. התא יוצר סביבת איסכמי שמגרה הנבטת angiogenic מכלי המושתל. 3 pedicle וסקולרית או יכול להיות לולאת arteriovenous משוחזרת או עורק זרימת דרך ללא פגע וריד. 3-6,19 זה ניבט pedicle וסקולרית תפקוד ו עורק נרחב רשת -capillary-ורידי המקשרת בשתי האמנותeriole ו ורידים ונגמרו pedicle וסקולרית. 3,20 יתר על כן, תא התמיכה החלול שמסביב מגן על הרקמות בפיתוח מן עיוות כוחות מכאניים פוטנציאל ומאריך את כונן איסכמי כדי לשפר כלי דם. 3,21,22 אם pedicle הכלי מושתל פשוט אל רקמות בריאות ולא בתוך המרחב המוגן של החדר, הנבטת angiogenic מפסיקה לאורך ציר הזמן הזהה פצע רגיל ולא רקמה חדשה תצטבר ברחבי pedicle. חוקרים השתמשו בתצורת in vivo זה לייצר תלת ממדי בונת רקמת כלי דם תפקודית עם כלי דם תומכים בגודל משמעות קלינית. 4,23 יתר על כן, בונת רקמת כלי דם המהונדסת עם pedicle וסקולרית השלמים שלה ניתן לקצור להשתלה בהמשך בבית במקום פציעה . 24,25 תרחיש ריאלי יותר קליני יהיה יצירת התא באתר המוחלט לשיקום היםUch כמו שד. לפיכך, גישת הנדסת דה נובו רקמה זו יכולה להיות פוטנציאל קליני לספק מקור חדש של רקמת יעד פונקציונלית עבור ניתוח שחזור. 26-28
הפרוטוקול הבא יספק מדריך כללי לבנות תא הנדסת רקמות in vivo vascularized בחולדה, אשר יכול להיות מותאמת במודלים של בעלי חיים שונים והעסיקה לבחון את התהליכים המורכבים של אנגיוגנזה, ייצור מטריקס, וגירת הסלולר בידול.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנדסה של מיקרו כיום נחקרת בעצם דרך שתי גישות. הראשונה כוללת פיתוח רשת כלי דם זו בזו קשר הדוק בתוך המבנה במבחנה כך שכאשר מושתלת, נימים מהמיטה וסקולרית מארח להתחבר עם אלה של המושתלים לבנות דרך inosculation תהליך הנקרא, ובכך להבטיח את האספקה של חומרים מזינים לא רק בפרי?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מענק מטעם NHMRC ו סטאפורד פוקס רפואי קרן. המחברים מודים בסיוע כירורגית של סו מקיי, ליליאנה פפה, אנה Deftereos ואמנדה Rixon של רפואי הניסיון יחידת כירורגים, חולי סנט וינסנט, מלבורן. התמיכה ניתנת גם על ידי מחלקת המדינה הממשלה ויקטוריאני של חדשנות, התעשייה תוכנית תמיכה תשתית מבצעית של אזורי פיתוח.
Materials
| 1 15 Blade Scalpel | Braun | BB515 | |
| 1 Toothed Adson Forceps | Braun | BD527R | |
| 1 Needle Holder | Braun | BM201R | |
| 1 Bipolar Coagulator | Braun | US335 | |
| 1 Micro Needle Holder B-15-8.3 | S & T | 00763 | |
| 1 Micro Dilator Forceps D-5a.2 | S & T | 00125 | |
| 1 Micro Jeweler's Forceps JF-5 | S & T | 00108 | |
| 1 Micro Scissors – Straight SAS-11 | S & T | 00098 | |
| 1 Micro Scissors – Curved SDC-11 | S & T | 00090 | |
| 2 Single Clamps B-3 | S & T | 00400 | |
| 2 10/0 nylon suture | S & T | 03199 | |
| 1 6/0 nylon suture | Braun | G2095469 | |
| 2 4/0 Silk Sutures | Braun | C0760145 | |
| Xilocaine 1% | Dealmed | 150733 | 10 mg/ml |
| Heparin Sodium | Dealmed | 272301 | 5000 UI / ml |
| Ringer Lactate | Baxter | JB2323 | 500 ml |
| 1 dome-shaped tissue engineering chamber | custom made | ||
| 1 flow-through chamber | custom made | ||
| Lectin I, Griffonia Simplicifolia | Vector Laboratories | B-1105 | 1.67 μg/mL |
| Troponin T antibody | Abcam | Ab8295 | 4 μg/mL |
| Human-specific Ku80 antibody | Abcam | Ab80592 | 0.06 μg/mL |
| Desmin antibody | Dako | M0760 | 2.55 μg/mL |
| Cell Tracker CM-DiI dye | Thermo Fisher Scientific | C-7000 | 3 mg/106 cells |
Riferimenti
- Spiliopoulos, K., et al. Current status of mechanical circulatory support: A systematic review. Cardiol Res Pract. , 574198 (2012).
- Hsu, P. L., Parker, J., Egger, C., Autschbach, R., Schmitz-Rode, T., Steinseifer, U. Mechanical circulatory support for right heart failure: Current technology and future outlook. Artif Organs. 36 (4), 332-347 (2012).
- Lokmic, Z., Stillaert, F., Morrison, W. A., Thompson, E. W., Mitchell, G. M. An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent, highly vascular, tissue-engineered construct. FASEB J. 21 (2), 511-522 (2007).
- Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).
- Tanaka, Y., Tsutsumi, A., Crowe, D. M., Tajima, S., Morrison, W. A. Generation of an autologous tissue (matrix) flap by combining an arteriovenous shunt loop with artificial skin in rats: preliminary report. B J Plast Surg. 53 (1), 51-57 (2000).
- Cronin, K. J., et al. New murine model of spontaneous autologous tissue engineering, combining an arteriovenous pedicle with matrix materials. Plast Reconstr Surg. 113 (1), 260-269 (2004).
- Forster, N. A., et al. A prevascularized tissue engineering chamber supports growth and function of islets and progenitor cells in diabetic mice. Islets. 3 (5), 271-283 (2011).
- Choi, Y. S., Matsuda, K., Dusting, G. J., Morrison, W. A., Dilley, R. J. Engineering cardiac tissue in vivo from human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (8), 2236-2242 (2010).
- Jeyaraj, R., G, N., Kirby, G., Rajadas, J., Mosahebi, A., Seifalian, A. M., Tan, A. Vascularisation in regenerative therapeutics and surgery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 54, 225-238 (2015).
- Dew, L., Macneil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
- Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
- Vacanti, J. P., Langer, R., Upton, J., Marler, J. J. Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 33 (1-2), 165-182 (1998).
- Beahm, E. K., Walton, R. L., Patrick, C. W. Progress in adipose tissue construct development. Clin Plast Surg. 30 (4), 547-558 (2003).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 169-187 (2010).
- Garcia, J. R., Garcia, A. J. Biomaterial-mediated strategies targeting vascularization for bone repair. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Forster, N., et al. Expansion and hepatocytic differentiation of liver progenitor cells in vivo using a vascularized tissue engineering chamber in mice. Tissue Eng Part C Methods. 17 (3), 359-366 (2011).
- Tilkorn, D. J., et al. Implanted myoblast survival is dependent on the degree of vascularization in a novel delayed implantation/prevascularization tissue engineering model. Tissue Eng Part A. 16 (1), 165-178 (2010).
- Chang, Q., Lu, F. A novel strategy for creating a large amount of engineered fat tissue with an axial vascular pedicle and a prefabricated scaffold. Med hypotheses. 79 (2), 267-270 (2012).
- Walton, R. L., Beahm, E. K., Wu, L. De novo adipose formation in a vascularized engineered construct. Microsurg. 24 (5), 378-384 (2004).
- Debels, H., Gerrand, Y. W., Poon, C. J., Abberton, K. M., Morrison, W. A., Mitchell, G. M. An adipogenic gel for surgical reconstruction of the subcutaneous fat layer in a rat model. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 87-103 (2008).
- Yap, K. K., et al. Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber. Biomaterials. 34 (16), 3992-4001 (2013).
- Findlay, M. W., et al. Tissue-engineered breast reconstruction: Bridging the gap toward large-volume tissue engineering in humans. Plast Reconstr Surg. 128 (6), 1206-1215 (2011).
- Tee, R., Morrison, W. A., Dusting, G. J., Liu, G. S., Choi, Y. S., Hsiao, S. T., Dilley, R. J. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 1992-1999 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Long-term stability of adipose tissue generated from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2283-2292 (2011).
- Sekine, H., et al. Endothelial cell coculture within tissue-engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts. Circulation. 118, 145-152 (2008).
- Ting, A. C., et al. The adipogenic potential of various extracellular matrices under the influence of an angiogenic growth factor combination in a mouse tissue engineering chamber. Acta Biomater. 10 (5), 1907-1918 (2014).
- Zhan, W., et al. Self-synthesized extracellular matrix contributes to mature adipose tissue regeneration in a tissue engineering chamber. Wound Repair Regen. 23 (3), 443-452 (2015).
- Messina, A., Bortolotto, S. K., Cassell, O. C., Kelly, J., Abberton, K. M., Morrison, W. A. Generation of a vascularized organoid using skeletal muscle as the inductive source. FASEB J. 19 (11), 1570-1572 (2005).
- Lim, S. Y., Hernández, D., Dusting, G. J. Growing vascularized heart tissue from stem cells. J Cardiovasc Pharmacol. 62 (2), 122-129 (2013).
- Poon, C. J., et al. Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue. Acta Biomater. 9 (3), 5609-5620 (2013).
- Dilley, R. J., Morrison, W. A. Vascularisation to improve translational potential of tissue engineering systems for cardiac repair. Int J Biochem Cell Biol. 56, 38-46 (2014).
- Lesman, A., Koffler, J., Atlas, R., Blinder, Y. J., Kam, Z., Levenberg, S. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Hussey, A. J., et al. Seeding of pancreatic islets into prevascularized tissue engineering chambers. Tissue Eng Part A. 15 (12), 3823-3833 (2009).
- Chen, X., Aledia, A. S., Popson, S. A., Him, L., Hughes, C. C., George, S. C. Rapid anastomosis of endothelial progenitor cell-derived vessels with host vasculature is promoted by a high density of cotransplanted fibroblasts. Tissue Eng Part A. 16 (2), 585-594 (2010).
- Lin, R. Z., Melero-Martin, J. M. Fibroblast growth factor-2 facilitates rapid anastomosis formation between bioengineered human vascular networks and living vasculature. Methods. 56 (3), 440-451 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Spontaneous large volume adipose tissue generation from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber space. Tissue Eng. 13 (4), 673-681 (2007).
- Wei, F. C., Lin Tay, S. K., Neligan, P. C., Gurtner, G. C. Principles and techniques of microvascular surgery. Plastic Surgery. Volume 1. , 587-620 (2013).
- Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat.Comm. 4 (1399), 1-10 (2013).
- Lim, S. Y., Sivakumaran, P., Crombie, D. E., Dusting, G. J., Pébay, A., Dilley, R. J. Trichostatin A enhances differentiation of human induced pluripotent stem cells to cardiogenic cells for cardiac tissue engineering. Stem Cells Transl Med. 2 (9), 715-725 (2013).
- Lim, S. Y., et al. In vivo tissue engineering chamber supports human induced pluripotent stem cell survival and rapid differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 422 (1), 75-79 (2012).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 787-791 (2014).
