Tissue Engineering von Intrinsic Vaskularisation in ein<em> In Vivo</em> Tissue Engineering Chamber
Summary
This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.
Abstract
In der rekonstruktiven Chirurgie gibt es einen klinischen Bedarf nach einer Alternative zu den derzeitigen Methoden der autologe Rekonstruktion, die komplex, teuer und Handel ein Defekt für einen anderen. Tissue Engineering hält das Versprechen dieser steigenden Nachfrage zu begegnen. Allerdings scheitern die meisten Tissue-Engineering-Strategien stabile und funktionelle Gewebeersatz zu erzeugen, wegen der schlechten Vaskularisierung. Dieses Dokument konzentriert sich auf ein in vivo Tissue Engineering Kammer Modell intrinsischen Vaskularisierung wo eine perfundiert Arterie und eine Vene entweder als arteriovenöse Schleife oder einer Durchfluss Pedikel Konfiguration innerhalb einer geschützten Hohlkammer gerichtet ist. In dieser Kammer-basierten System tritt angiogenen Sprießen von den arteriovenöse Gefäße und dieses System zieht ischämischen und entzündlichen endogene Zellmigration angetrieben, die den Kammerraum mit Fibro-Gefäßgewebe allmählich füllt. Exogene Zell / Matrix-Implantation bei der Kammerkonstruktion verbessert Zelle surVival und bestimmt die Spezifität der engineered Gewebe, die zu entwickeln. Unsere Studien haben gezeigt, dass diese Kammer Modell erfolgreich verschiedene Gewebe wie Fett, Herzmuskel, Leber und andere erzeugen kann. Allerdings sind Änderungen und Verbesserungen erforderlich Zielgewebe, um sicherzustellen, Bildung konsistent und reproduzierbar ist. Dieser Artikel beschreibt ein standardisiertes Protokoll für die Herstellung von zwei verschiedenen vaskularisierten Gewebetechnik Kammer Modelle in vivo.
Introduction
Die Herstellung von funktionellen bluteten Gewebe ein Tissue – Engineering – Ansatz ist eine neue Paradigma in der regenerativen Medizin. 1,2 Viele Ansätze zu konstruieren neue und gesunde Gewebe für den Ersatz von verletztem Gewebe oder defekte Organe entwickelt, 3-6 experimentell in kleinen Tiermodellen mit vielversprechende klinische Potenzial. 7,8 jedoch Vaskularisierung bleibt eine der großen Herausforderungen für das Tissue Engineering sein Potenzial zu begrenzen Gewebe klinisch relevanter Größe zu wachsen. 9
Aktuelle Ansätze Gewebe folgen entweder eine extrinsische Weg zu vaskularisieren wo neue Schiffe von der Empfängergefäßbett wachsen und dringen überall in das implantierte Gewebe konstruiert 10 oder eine intrinsische Vaskularisierung Weg , wo das Gefäßsystem wächst und dehnt sich im Einklang mit dem neu entstehenden Gewebes. 11 Der extrinsische Ansatz traditionell beinhaltet Seeding Zellen auf ein Gerüstin vitro und das vollständige Konstrukt in das lebende Tier mit der Erwartung , Implantieren , die Nährstoffe, die zuvor von Kulturmedien zugeführt wird , wird aus dem Kreislauf stammen. 12,13 Das Konzept vereinfachend als vaskuläre Einwachsen zu langsam und nur sehr dünne Implantate (< 1-2 mm dick) wird lebensfähig bleiben. Bereitstellung von Nährstoffen und Sauerstoff durch eine schnelle und ausreichende Vaskularisierung im Herzen eines jeden erfolgreichen Versuche ist komplexer und größer Tissue-Engineering – Ersatzstoffe wie Knochen, Muskeln, Fett und soliden Organen zu wachsen. 14,15 Intrinsic Vaskularisierung bietet das Potenzial für größere Konstrukte durch progressive Gewebewachstum, die seinem wachsenden Blutversorgung zu entwickeln. Ein Design ist die in vivo – Implantation in eine Kammer eines Gefäßstiel mit oder ohne einer Zelle seeded Gerüst. 5,6 dies der Weg zu neuen Verfahren zur Erzeugung von dickeren intrinsisch vaskularisierten Geweben geebnet. 16,17 </ P>
vorab vaskularisieren Gewebetransplantate, vor der Implantation in jüngster Zeit wurden Strategien entwickelt. Diese integriert Blutgefäßnetze zielen darauf ab , mit dem Host – Schiffen bei der Implantation zu inosculate so dass für die schnelle Bereitstellung einer vollständigen Blutversorgung das Überleben aller Teile eines transplantierten dicken Gewebetransplantats zu verbessern. 18
Wir waren die ersten in vivo eine gefäß Tissue Engineering Modell in Kleintiere , die eine subkutan implantierte halbstarre geschlossene Kammer , die einen durchbluteten Gefäßstiel und zellhaltigen Biomaterialien umfasst. Die Kammer schafft eine ischämische Umgebung , die von den implantierten Gefäße angiogenen Sprießen stimuliert. 3 Der Gefäßstiel kann entweder eine rekonstruierte arteriovenöse Schleife oder eine intakte Durchfluss Arterie und Vene sein. 3-6,19 Diese Gefäßstiel Sprossen eine funktionierende und umfassende arterio -capillary-venöse Netzwerk, das sowohl auf Kunst verbindeteriole und venöse endet mit dem Gefäßstiel. 3,20 Darüber hinaus ist die umgebende hohle Stützkammer schützt die Entwicklung von Gewebe vor potenziell mechanischen Kräften verformt und verlängert die ischämische Antrieb Vaskularisierung zu verbessern. 3,21,22 Wenn das Schiff pedicle einfach in implantiert normales Gewebe und nicht innerhalb des geschützten Raum der Kammer, hört angiogenen Sprießen entlang der gleichen Zeitachse wie eine normale Wunde und kein neues Gewebe wird um den Stiel akkumulieren. Forscher haben diese in vivo – Konfiguration verwendet dreidimensionalen Funktions vaskularisierten Gewebekonstrukte mit unterstützenden Vaskulatur zu produzieren und klinisch relevanter Größe. 4,23 Weiteren die gentechnisch vaskularisierten Gewebekonstrukte mit seiner intakten Gefäßstiel kann zur anschließenden Transplantation an der Verletzungsstelle geerntet . Eine klinisch machbar Szenario die Kammer für den Wiederaufbau s 24,25 im Rahmen der endgültigen Standort erschaffen würdeuch als die Brust. Somit könnte diese de novo Tissue Engineering Ansatz haben klinische Potenzial eine neue Quelle der funktionellen Zielgewebe für die rekonstruktive Chirurgie bereitzustellen. 26-28
Das folgende Protokoll wird eine allgemeine Anleitung geben einen in vivo vaskularisierten Gewebetechnik Kammer in der Ratte zu konstruieren, die in verschiedenen Tiermodellen und eingesetzt angepasst werden, um die komplizierten Prozesse der Angiogenese, der Matrixproduktion und zelluläre Migration und Differenzierung zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Technik der Mikrozirkulation wird derzeit im Wesentlichen durch zwei Ansätze untersucht. Die erste umfasst innerhalb des Konstrukts in vitro eine hoch vernetzte vaskuläre Netzwerk entwickeln , so dass , wenn es implantiert, Kapillaren vom Host Gefäßbett mit denen das durch einen Prozess namens inosculation konstruieren transplantierten verbinden, wodurch die Lieferung von Nährstoffen nicht nur an die Peripherie zu gewährleisten , aber auch auf den Kern. 21,32,33 Dies wird pre-Vaskularisierung g…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus NHMRC und Stafford Fox Medical Foundation unterstützt. Die Autoren erkennen die chirurgische Hilfe von Sue McKay, Liliana Pepe, Anna Deftereos und Amanda Rixon der Experimental medizinischen und chirurgischen Einheit, St. Vincent Hospital in Melbourne. Unterstützung wird auch von der viktorianischen Staatsregierung Department of Innovation, Industrie und regionale Entwicklung operative Infrastruktur-Support-Programm zur Verfügung gestellt.
Materials
| 1 15 Blade Scalpel | Braun | BB515 | |
| 1 Toothed Adson Forceps | Braun | BD527R | |
| 1 Needle Holder | Braun | BM201R | |
| 1 Bipolar Coagulator | Braun | US335 | |
| 1 Micro Needle Holder B-15-8.3 | S & T | 00763 | |
| 1 Micro Dilator Forceps D-5a.2 | S & T | 00125 | |
| 1 Micro Jeweler's Forceps JF-5 | S & T | 00108 | |
| 1 Micro Scissors – Straight SAS-11 | S & T | 00098 | |
| 1 Micro Scissors – Curved SDC-11 | S & T | 00090 | |
| 2 Single Clamps B-3 | S & T | 00400 | |
| 2 10/0 nylon suture | S & T | 03199 | |
| 1 6/0 nylon suture | Braun | G2095469 | |
| 2 4/0 Silk Sutures | Braun | C0760145 | |
| Xilocaine 1% | Dealmed | 150733 | 10 mg/ml |
| Heparin Sodium | Dealmed | 272301 | 5000 UI / ml |
| Ringer Lactate | Baxter | JB2323 | 500 ml |
| 1 dome-shaped tissue engineering chamber | custom made | ||
| 1 flow-through chamber | custom made | ||
| Lectin I, Griffonia Simplicifolia | Vector Laboratories | B-1105 | 1.67 μg/mL |
| Troponin T antibody | Abcam | Ab8295 | 4 μg/mL |
| Human-specific Ku80 antibody | Abcam | Ab80592 | 0.06 μg/mL |
| Desmin antibody | Dako | M0760 | 2.55 μg/mL |
| Cell Tracker CM-DiI dye | Thermo Fisher Scientific | C-7000 | 3 mg/106 cells |
Riferimenti
- Spiliopoulos, K., et al. Current status of mechanical circulatory support: A systematic review. Cardiol Res Pract. , 574198 (2012).
- Hsu, P. L., Parker, J., Egger, C., Autschbach, R., Schmitz-Rode, T., Steinseifer, U. Mechanical circulatory support for right heart failure: Current technology and future outlook. Artif Organs. 36 (4), 332-347 (2012).
- Lokmic, Z., Stillaert, F., Morrison, W. A., Thompson, E. W., Mitchell, G. M. An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent, highly vascular, tissue-engineered construct. FASEB J. 21 (2), 511-522 (2007).
- Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).
- Tanaka, Y., Tsutsumi, A., Crowe, D. M., Tajima, S., Morrison, W. A. Generation of an autologous tissue (matrix) flap by combining an arteriovenous shunt loop with artificial skin in rats: preliminary report. B J Plast Surg. 53 (1), 51-57 (2000).
- Cronin, K. J., et al. New murine model of spontaneous autologous tissue engineering, combining an arteriovenous pedicle with matrix materials. Plast Reconstr Surg. 113 (1), 260-269 (2004).
- Forster, N. A., et al. A prevascularized tissue engineering chamber supports growth and function of islets and progenitor cells in diabetic mice. Islets. 3 (5), 271-283 (2011).
- Choi, Y. S., Matsuda, K., Dusting, G. J., Morrison, W. A., Dilley, R. J. Engineering cardiac tissue in vivo from human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (8), 2236-2242 (2010).
- Jeyaraj, R., G, N., Kirby, G., Rajadas, J., Mosahebi, A., Seifalian, A. M., Tan, A. Vascularisation in regenerative therapeutics and surgery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 54, 225-238 (2015).
- Dew, L., Macneil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
- Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
- Vacanti, J. P., Langer, R., Upton, J., Marler, J. J. Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 33 (1-2), 165-182 (1998).
- Beahm, E. K., Walton, R. L., Patrick, C. W. Progress in adipose tissue construct development. Clin Plast Surg. 30 (4), 547-558 (2003).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 169-187 (2010).
- Garcia, J. R., Garcia, A. J. Biomaterial-mediated strategies targeting vascularization for bone repair. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Forster, N., et al. Expansion and hepatocytic differentiation of liver progenitor cells in vivo using a vascularized tissue engineering chamber in mice. Tissue Eng Part C Methods. 17 (3), 359-366 (2011).
- Tilkorn, D. J., et al. Implanted myoblast survival is dependent on the degree of vascularization in a novel delayed implantation/prevascularization tissue engineering model. Tissue Eng Part A. 16 (1), 165-178 (2010).
- Chang, Q., Lu, F. A novel strategy for creating a large amount of engineered fat tissue with an axial vascular pedicle and a prefabricated scaffold. Med hypotheses. 79 (2), 267-270 (2012).
- Walton, R. L., Beahm, E. K., Wu, L. De novo adipose formation in a vascularized engineered construct. Microsurg. 24 (5), 378-384 (2004).
- Debels, H., Gerrand, Y. W., Poon, C. J., Abberton, K. M., Morrison, W. A., Mitchell, G. M. An adipogenic gel for surgical reconstruction of the subcutaneous fat layer in a rat model. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 87-103 (2008).
- Yap, K. K., et al. Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber. Biomaterials. 34 (16), 3992-4001 (2013).
- Findlay, M. W., et al. Tissue-engineered breast reconstruction: Bridging the gap toward large-volume tissue engineering in humans. Plast Reconstr Surg. 128 (6), 1206-1215 (2011).
- Tee, R., Morrison, W. A., Dusting, G. J., Liu, G. S., Choi, Y. S., Hsiao, S. T., Dilley, R. J. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 1992-1999 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Long-term stability of adipose tissue generated from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2283-2292 (2011).
- Sekine, H., et al. Endothelial cell coculture within tissue-engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts. Circulation. 118, 145-152 (2008).
- Ting, A. C., et al. The adipogenic potential of various extracellular matrices under the influence of an angiogenic growth factor combination in a mouse tissue engineering chamber. Acta Biomater. 10 (5), 1907-1918 (2014).
- Zhan, W., et al. Self-synthesized extracellular matrix contributes to mature adipose tissue regeneration in a tissue engineering chamber. Wound Repair Regen. 23 (3), 443-452 (2015).
- Messina, A., Bortolotto, S. K., Cassell, O. C., Kelly, J., Abberton, K. M., Morrison, W. A. Generation of a vascularized organoid using skeletal muscle as the inductive source. FASEB J. 19 (11), 1570-1572 (2005).
- Lim, S. Y., Hernández, D., Dusting, G. J. Growing vascularized heart tissue from stem cells. J Cardiovasc Pharmacol. 62 (2), 122-129 (2013).
- Poon, C. J., et al. Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue. Acta Biomater. 9 (3), 5609-5620 (2013).
- Dilley, R. J., Morrison, W. A. Vascularisation to improve translational potential of tissue engineering systems for cardiac repair. Int J Biochem Cell Biol. 56, 38-46 (2014).
- Lesman, A., Koffler, J., Atlas, R., Blinder, Y. J., Kam, Z., Levenberg, S. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Hussey, A. J., et al. Seeding of pancreatic islets into prevascularized tissue engineering chambers. Tissue Eng Part A. 15 (12), 3823-3833 (2009).
- Chen, X., Aledia, A. S., Popson, S. A., Him, L., Hughes, C. C., George, S. C. Rapid anastomosis of endothelial progenitor cell-derived vessels with host vasculature is promoted by a high density of cotransplanted fibroblasts. Tissue Eng Part A. 16 (2), 585-594 (2010).
- Lin, R. Z., Melero-Martin, J. M. Fibroblast growth factor-2 facilitates rapid anastomosis formation between bioengineered human vascular networks and living vasculature. Methods. 56 (3), 440-451 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Spontaneous large volume adipose tissue generation from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber space. Tissue Eng. 13 (4), 673-681 (2007).
- Wei, F. C., Lin Tay, S. K., Neligan, P. C., Gurtner, G. C. Principles and techniques of microvascular surgery. Plastic Surgery. Volume 1. , 587-620 (2013).
- Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat.Comm. 4 (1399), 1-10 (2013).
- Lim, S. Y., Sivakumaran, P., Crombie, D. E., Dusting, G. J., Pébay, A., Dilley, R. J. Trichostatin A enhances differentiation of human induced pluripotent stem cells to cardiogenic cells for cardiac tissue engineering. Stem Cells Transl Med. 2 (9), 715-725 (2013).
- Lim, S. Y., et al. In vivo tissue engineering chamber supports human induced pluripotent stem cell survival and rapid differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 422 (1), 75-79 (2012).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 787-791 (2014).
