Infarctus du myocarde chez les souris néonatales, Un modèle de régénération cardiaque

Summary

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Abstract

L'infarctus du myocarde induite par la ligature de l'artère coronaire a été utilisé dans de nombreux modèles animaux comme un outil pour étudier les mécanismes de réparation et la régénération cardiaque, et pour définir de nouvelles cibles thérapeutiques. Pendant des décennies, les modèles de régénération complète du cœur existait chez les amphibiens et les poissons, mais un homologue de mammifère était pas disponible. La découverte récente d'une fenêtre post-natale au cours de laquelle les souris possèdent des capacités de régénération a conduit à la création d'un modèle de mammifère de la régénération cardiaque. Un modèle chirurgical de régénération cardiaque de mammifère chez la souris néonatale est présentée ici. En bref, le jour 1 (P1) des souris postnatale sont anesthésiés par l'isoflurane et placé sur un socle de glace pour induire une hypothermie. Après la poitrine est ouverte, et la descendante antérieure gauche de l'artère coronaire (LAD) est visualisé, un fil de suture est placé autour de la LAD pour infliger une ischémie myocardique dans le ventricule gauche. La procédure chirurgicale prend 10-15 min. Visualiser l'artère coronaire estcruciale pour le placement de suture précise et la reproductibilité. L'infarctus du myocarde et l'insuffisance cardiaque sont confirmés par le chlorure de triphényl-tétrazolium (TTC) coloration et l'échocardiographie, respectivement. régénération complète 21 jours après l'infarctus du myocarde est vérifiée par histologie. Ce protocole peut être utilisé comme un outil pour élucider les mécanismes de régénération cardiaque après un infarctus du myocarde chez les mammifères.

Introduction

L' infarctus du myocarde (MI) est une cause majeure de décès dans le monde, et reste responsable d'environ un tiers des cas d'insuffisance cardiaque ^1. Alors que l'apparition d'une intervention percutanée et une optimisation continue de l'utilisation des thrombolytiques a augmenté reperfusion après un infarctus, la mort des cardiomyocytes et la perte de contractilité du myocarde se produit néanmoins. Il reste aussi un grand nombre de patients «non-option" qui ne sont pas candidats à ou ne voient pas bénéficier de ces interventions. Ces patients continuent de subir une ischémie invalidantes conduisant à la formation de cicatrice et délétère remodelage ventriculaire comme un mécanisme d'infarctus guérison. Ce processus aboutit finalement à une insuffisance cardiaque, dont le pronostic reste faible malgré une gestion pharmacologique optimal avec l'enzyme (ECA) de conversion de l'angiotensine et des bêta-bloquants. Malheureusement, le taux de mortalité à un an pour les patients dont la fonction ventriculaire gauche sévèrement altérée reste toujours aussiélevé que 26% ^2. Transplantation cardiaque est l'option de traitement final pour les patients souffrant d'insuffisance cardiaque. Cependant, la piscine limitée des donateurs pour la transplantation cardiaque ne fait pas cette option viable pour la plupart des patients. Ainsi, la découverte de nouveaux agents thérapeutiques pour restaurer le myocarde endommagé reste primordial de résoudre le problème de la maladie cardiaque. modèles animaux fiables de lésions cardiaques sont donc nécessaires comme un élément essentiel de ce processus.

Le dogme traditionnel a dicté que des cardiomyocytes adultes sont post-mitotique, les cellules différenciées, incapable de diviser ou de-différenciation pour remplacer le myocarde endommagé ^3. En tant que tel, un coeur de mammifère adulte ne pourrait jamais récupérer complètement d'une blessure, et cardiomyocytes perdus serait remplacé par du tissu fibreux. Ainsi, les recherches ont porté principalement sur des agents thérapeutiques afin de minimiser l'expansion de l'infarctus et de réduire la formation de cicatrice. Plus récemment, cependant, un changement de paradigme a eu lieudans la pensée entourant la guérison cardiaque et de nombreux efforts de recherche ont été réorientées pour se concentrer sur le potentiel de régénération cardiaque ^4.

Jusqu'à une date récente, l' étude in vivo de la régénération cardiaque a été limitée à des modèles non-vertébrés, tels que ceux chez les amphibiens et les poissons téléostéens urodèles poisson ^5-7. Cependant, la découverte de la capacité de régénération cardiaque chez la souris néonatale a conduit à l'élaboration de deux modèles chirurgicaux de régénération cardiaque chez les mammifères: résection de l'occlusion de l' artère coronaire cardiaque sommet et à induire un infarctus du myocarde ^8,9. En 2011, un modèle de résection apex de la souris a été utilisé pour démontrer que la régénération cardiaque complet est disponible à jour postnatal 1 (P1). Cependant, cette capacité diminue rapidement après la période néonatale initiale. Le coeur de mammifère perd son potentiel de régénération peu après la naissance à P7 que le nombre de cellules progénitrices déclin, et les cardiomyocytes devenir binucléées, perdreleur capacité proliférative, et de façon permanente quitter le ^10,11 du cycle cellulaire. Comprendre les différences fondamentales entre le nouveau-né et coeur de mammifère adulte peut conduire à de nouveaux aperçus sur la régénération cardiaque.

Bien que la résection apex offre en effet un aperçu de re-croissance du tissu contractile, le modèle ne simule pas la lésion cardiaque humain typique, et donc ne se prête pas aussi bien pour le développement de thérapies. Le modèle d'occlusion de l'artère coronaire, cependant, simule plus directement les aspects physiopathologiques de MI pathologie, et peut donc fournir des indications plus utiles dans les mécanismes qui peuvent être applicables à l'avancement thérapeutique à usage humain.

La ligature coronaire chirurgicale a été utilisée comme une technique expérimentale utile dans de nombreux modèles animaux de ^12-14. Dans l'artère coronaire modèle de ligature des adultes, les animaux sont anesthésiés et intubé pour permettre l'ouverture de la cavité de la poitrine tout en maintenant respiratisur. Le cœur continue de battre régulièrement, ce qui permet la visualisation de la vascularisation coronaire et permettant le placement de suture précise. En outre, le cœur reste rose comme perfusion continue, et après ligature du myocarde ischémique apparaît pâle, indiquant la réussite ligature de l'artère coronaire. Le protocole décrit pour les souris néonatales, cependant, est moins fiable que l'artère coronaire n'a pas été visualisé et le chirurgien doit estimer l' endroit où placer le fil de suture ^15. Bien que l'anatomie générale de la vasculature coronaire est la même, la variabilité individuelle des animaux dans la direction et la ramification de la DAL existe ^16. Ainsi, lorsque «aller en aveugle," l'artère pourrait facilement être manquée. D'autres techniques telles que l'échocardiographie sont alors nécessaires pour confirmer l'induction réussie de MI, et d'assurer toutes les interventions chirurgicales entraînent une taille de l'infarctus similaire. Décrite ici est une amélioration sur une méthode récemment publiée ^15, où la position de la LAD peut être établies et donc LAD peuvent être ligaturées à induire reproductible MI.

Cette technique ne nécessite pas l'intubation endotrachéale ou une ventilation mécanique, comme thoracotomie dans un état hypothermique chez la souris néonatale ne conduit pas à l'effondrement du poumon. Cependant, dans le procédé décrit précédemment, l' hypothermie sévère doit être induite au point à la fois l' apnée complète et la cessation du rythme cardiaque ^15. La principale limite de cette approche est que l'artère coronaire est plus perfusé et le cœur apparaît pâle avant même LAD ligature. Dans l'approche décrite ici, la visualisation de l'artère coronaire est possible à un point de torpeur avant l'hypothermie profonde et du rythme cardiaque cessation, avec le rétablissement complet de la souris néonatale après la chirurgie. Cette méthode offre un avantage majeur de reproductibilité à 100%.

Protocol

Les couples reproducteurs de C57BL / 6 et souris CD-1 IG-S ont été achetés auprès de Charles River. Les animaux utilisés dans cette étude ont été traitées conformément aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux, et des protocoles d'étude ont été approuvés par le Sous-Comité utilisation des animaux à l'Université Western, London, Canada. 1. Animal Care Après l'accouchement est terminée et les chiots ont été initialement nou…

Representative Results

La procédure d'infarctus du myocarde à P1 peut être achevée en 10-15 min et a un taux de 7,8% (de petits 5 sur 64) de la mortalité. Après la chirurgie, les souris se remettre de l'anesthésie hypothermiques dans les 5 prochaines – 20 min (temps de récupération dépend de la température du corps atteint au cours de l'anesthésie et de la vitesse du chirurgien). Lors de l'utilisation des chiots P7 (par comparaison avec un myocarde non régénératif), une période …

Discussion

La ligature de LAD chirurgicale démontré ici est une méthode fiable pour produire MI chez les souris néonatales. Ce modèle fournit aux chercheurs un modèle reproductible avec lequel pour étudier les mammifères la régénération cardiaque. Visualisation de la vasculature coronaire est un élément clé de cette méthode, assurant le placement de suture correcte et garantissant ainsi la reproductibilité. Alors que les souris adultes ne possèdent pas les capacités poïkilothermes, la température du corps et le…

Materials

8-0 Nylon Suture	Microsurgery Instruments	8-0 Nylon
11-0 Nylon Suture	Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd	H1101
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-09
Small forceps	Fine Science Tools	11063-07
Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12060-02
Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope	Zeiss	300002
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Isoflurane Chamber	Made in Feng laboratory
Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC)	Sigma	T8877
Stereomicroscope SteREO Discovery. V8	Zeiss	435400
AxioVision 8.0	Zeiss
Axiocam Icc5	Zeiss	426554
Heat pad	Sunbeam	731A0-CN
Sterile Gloves	VWR	414004-430
Gauze Sponges	Ducare	90212
Ice