Инфаркт миокарда у новорожденных мышей, Модель регенерации сердца
Summary
This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.
Abstract
Инфаркт миокарда, индуцированный перевязки коронарной артерии была использована во многих моделях животных в качестве инструмента для изучения механизмов сердечного восстановления и регенерации, а также определить новые цели для терапии. В течение многих десятилетий, модели полной регенерации сердца существовали у амфибий и рыб, но аналог млекопитающее не был доступен. Недавнее открытие послеродового окна, во время которого у мышей обладают регенеративные способности привело к созданию модели млекопитающих регенерации сердца. Хирургическая модель регенерации сердца млекопитающих в неонатальном мыши представлен в настоящем документе. В кратком изложении, постнатальный день 1 (P1), мышей анестезировали изофлуран и помещают на ледяную площадку, чтобы вызвать переохлаждение. После того, как грудь открыта, а левая передней нисходящей коронарной артерии (LAD) визуализируется, шовный материал помещается вокруг LAD, чтобы нанести ишемию миокарда в левом желудочке. Хирургическая процедура занимает 10-15 мин. Визуализируя коронарной артерииимеет решающее значение для точного размещения шовного и воспроизводимости. Инфаркт миокарда и сердечной дисфункции подтверждаются хлоридом трифенил-тетразолия (TTC) окрашивания и эхокардиографии, соответственно. Полное восстановление 21 дней после инфаркта миокарда подтверждается гистологии. Этот протокол может быть использован, чтобы в качестве инструмента для выяснения механизмов регенерации сердца у млекопитающих после инфаркта миокарда.
Introduction
Инфаркт миокарда (ИМ) является ведущей причиной смерти во всем мире, и остается ответственным за около одной трети случаев сердечной недостаточности 1. В то время как появление чрескожного вмешательства и непрерывной оптимизации использования тромболитиков увеличилась реперфузии следующее ИМ, смерть кардиомиоцитов и потеря сократительной миокарда, тем не менее происходит. Там также остаются большое количество "не-опция" пациентов, которые не являются кандидатами на или не видят пользы от этих мер. Эти пациенты продолжают испытывать инвалидизирующих ишемию, приводящие к образованию шрам и пагубное желудочков ремоделирования как механизм исцеления инфаркта. Этот процесс в конечном итоге приводит к сердечной недостаточности, для которых прогноз остается низкой, несмотря на оптимальную фармакологического управления с ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) и бета-блокаторы. К сожалению, уровень смертности один год для пациентов с тяжелыми нарушениями функции левого желудочка по-прежнему остаетсявыше , чем 26% 2. По пересадке сердца является окончательным вариантом лечения для пациентов с сердечной недостаточностью. Однако ограниченный пул доноров для трансплантации сердца не делает это жизнеспособным вариантом для большинства пациентов. Таким образом, открытие новых терапевтических агентов для восстановления поврежденного миокарда остается первостепенное значение для решения проблемы сердечно-сосудистые заболевания. Надежные модели на животных сердечной травмы, следовательно, требуется в качестве важного компонента этого процесса.
Традиционная догма диктовали , что взрослые кардиомиоциты постмитотическими, терминально дифференцированных клеток, неспособны к делению или де-дифференциации , чтобы заменить поврежденный миокард 3. Таким образом, взрослый сердце млекопитающих никогда не сможет полностью оправиться от травмы, и потерянные кардиомиоциты будут заменены фиброзной тканью. Таким образом, исследование сосредоточилось главным образом на терапевтических агентов с целью свести к минимуму расширение зоны инфаркта и уменьшить образование рубцов. Однако последнее время, смена парадигмы произошлов мышлении окружающего сердца исцеление и многие исследовательские усилия были перенаправлены , чтобы сосредоточиться на потенциал регенерации сердца 4.
До недавнего времени исследования в естественных условиях регенерации сердца был ограничен не-позвоночных животных моделей, таких , как те , в urodele амфибий и костистых рыб 5-7. Тем не менее, открытие способности к регенерации сердца в неонатальном мыши привело к разработке двух хирургических моделей регенерации сердца млекопитающих: резекция верхушки корня и коронарной окклюзии артерии сердца , чтобы вызвать инфаркт миокарда 8,9. В 2011 году модель мыши апекс резекция была использована, чтобы продемонстрировать, что полная регенерация сердца возможна в постнатальный день 1 (P1). Тем не менее, эта способность быстро снижается после того, как начальный неонатальном периоде. Сердце млекопитающих теряет свой регенеративный потенциал вскоре после рождения в Р7 как числа клеток-предшественников упадка, и кардиомиоцитов становятся двуядерных, теряютих пролиферативная компетентность, и постоянно выходить из 10,11 клеточного цикла. Понимание основных различий между неонатальной и взрослого сердца млекопитающих может привести к новым проникновения в регенерации сердца.
В то время как апекс резекция действительно дает представление о отрастает сократительной ткани, модель не моделирует типичную сердечную травму человека, и, таким образом, не поддается, а также к разработке терапевтических средств. Модель окклюзии коронарной артерии, тем не менее, более непосредственно моделирует патофизиологических аспекты МИ патологии, и, таким образом, может обеспечить более полезную информацию о механизмах, которые могут быть применимы к терапевтическому продвижению для человека.
Хирургический коронарный лигирование использовалась в качестве полезной экспериментальной техники во многих животных моделях 12-14. Во взрослом модели лигирования коронарной артерии, животных анестезируют и интубацию, чтобы отверстие полости грудной клетки при сохранении respiratiна. Сердце продолжает регулярно бить, позволяя визуализацию коронарных сосудов и позволяет для точного размещения шва. Кроме того, сердце остается розовым, как перфузия продолжается, и после перевязки ишемический миокард выглядит бледным, что указывает на успешную перевязки коронарной артерии. Протокол , описанный для новорожденных мышей, однако, является менее надежным коронарной артерии не визуализируется и хирург должен оценить , где поместить шов 15. Хотя общая анатомия коронарных сосудов является такой же, индивидуальная изменчивость животного в направлении и разветвленность ЛАД существует 16. Таким образом, когда "происходит в слепую," артерия может быть легко пропустить. Другие методы, такие как эхокардиографии затем требуется для подтверждения успешного индукции инфаркта миокарда, а также гарантировать, что все операции приводят к подобным размера инфаркта. Описанная здесь улучшение по недавно опубликованным методом 15, где положение ЛАД может быть Estabваны, таким образом ЛАД может быть лигированы с воспроизводимым вызвать инфаркт миокарда.
Этот метод не требует интубации трахеи или механической вентиляции, как торакотомии в Гипотермическую состоянии в неонатальном мыши не приводит к коллапсу легкого. Тем не менее, в описанном выше способе, тяжелой гипотермии должны быть индуцированы к точке как в полной одышки и прекращения сердечного ритма 15. Основным недостатком такого подхода является то, что коронарной артерии больше не озарен, а сердце выглядит бледным еще до ЛАД перевязки. В подходе, описанном в настоящем документе, визуализации коронарной артерии возможно в точке оцепенения до глубокой гипотермии и сердечного ритма прекращения, с полным восстановлением новорожденных мышей после операции. Этот метод дает значительное преимущество 100% воспроизводимости.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хирургический ЛАД лигирование показано здесь является надежным методом для получения ИМ у новорожденных мышей. Эта модель предоставляет исследователям воспроизводимой модели, с которой для изучения млекопитающих регенерации сердца. Визуализация коронарных артерий является ключев?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by an operating grant from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) to Q.F. (grant #MOP-119600).
Materials
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice |
Riferimenti
- Rosamond, W., et al. Heart disease and stroke statistics–2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 117 (4), 25-146 (2008).
- . Meta-analysis Global Group in Chronic Heart Failure. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. Eur Heart J. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- D’Uva, G., et al. ERBB2 triggers mammalian heart regeneration by promoting cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nat Cell Biol. 17 (5), 627-638 (2015).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J Exp Zool. 187 (2), 249-253 (1974).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Haubner, B. J., et al. Complete cardiac regeneration in a mouse model of myocardial infarction. Aging. 4 (12), 966-977 (2012).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271, 2183-2189 (1996).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28 (8), 1737-1746 (1996).
- Feng, Q., et al. Elevation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in experimental congestive heart failure. Cardiovasc Res. 37 (3), 667-675 (1998).
- Xiang, F. L., et al. Cardiomyocyte-specific overexpression of human stem cell factor improves cardiac function and survival after myocardial infarction in mice. Circulation. 120 (12), 1065-1074 (2009).
- van Kats, J. P., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II type 1 receptor blockade prevent cardiac remodeling in pigs after myocardial infarction: role of tissue angiotensin II. Circulation. 102 (13), 1556-1563 (2000).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9 (2), 305-311 (2014).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Kao, W. W., Xia, Y., Liu, C. Y., Saika, S. Signaling pathways in morphogenesis of cornea and eyelid. Ocul Surf. 6 (1), 9-23 (2008).
- Redfors, B., Shao, Y. Z., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Experimental & Clinical Cardiology. 17 (4), 268-272 (2012).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38 (6), 887-890 (1986).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Mahmoud, A. I., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
