新生児マウスの心筋梗塞、心臓再生のモデル
Summary
This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.
Abstract
冠状動脈の結紮によって誘導される心筋梗塞は、心臓の修復および再生のメカニズムを研究するために、および治療のための新しいターゲットを定義するためのツールとして、多くの動物モデルにおいて使用されています。何十年もの間、完全な心臓再生のモデルは、両生類、魚類に存在していたが、哺乳類のカウンターパートは使用できませんでした。マウスは、回生能力を持っている間、生後ウィンドウの最近の発見は、心臓再生の哺乳動物モデルの確立につながっています。新生児マウスでは、哺乳動物の心臓再生の外科的モデルが本明細書に提示されます。簡潔には、生後1日目（P1）マウスをイソフルランで麻酔し、低体温を誘導するために氷のパッドの上に配置されます。胸を開いて、冠状動脈（LAD）を左前が可視化された後に、縫合糸は、左心室における心筋虚血を与えるためにLADの周りに配置されています。外科的手順は、10〜15分かかります。冠動脈をされている可視化正確な縫合糸の配置と再現性のために重要。心筋梗塞や心機能障害は、それぞれ、トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）染色および心エコー検査によって確認されています。完全再生後21日心筋梗塞は、組織学によって確認されます。このプロトコルは、心筋梗塞後の哺乳動物の心臓再生のメカニズムを解明するためのツールとして使用することができます。
Introduction
心筋梗塞（MI）は、世界中で死亡の主な原因であり、心不全症例1の約3分の1の原因で残ります。血栓溶解剤の使用の経皮的介入と連続最適化の出現は、MI後の再灌流を増加している一方で、収縮心筋の心筋細胞死と損失にもかかわらず発生します。またための候補ではないか、これらの介入から利益が表示されていない「無オプション」多数の患者が残っています。これらの患者は、梗塞治癒のメカニズムとして瘢痕形成および有害な心室リモデリングにつながる虚血を無効にすることを経験し続けています。このプロセスは、最終的な予後は、アンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤およびβ遮断薬との最適な薬理学的管理にもかかわらず、乏しいままであるため心不全をもたらします。残念ながら、重度障害者の左心室機能を持つ患者のための1年間の死亡率は依然として残ります26％2と高いです。心臓移植は心不全患者のための最終的な治療選択肢です。しかし、心臓移植のための限られたドナープールは、このほとんどの患者のための実行可能な選択肢がありません。従って、損傷した心筋を回復するための新規治療薬の発見は、心疾患の問題を解決するための最優先事項のままです。心臓傷害の信頼できる動物モデルは、したがって、このプロセスの重要な構成要素として必要とされています。
伝統的な教義は、成人心筋細胞が分裂または損傷した心筋3を交換するために脱分化することができない有糸分裂後、最終分化細胞であることを決定付けました。このように、成人の哺乳類の心臓が完全に負傷から回復することができませんでしたし、失われた心筋細胞は、線維組織に置き換えます。したがって、研究は、梗塞の拡大を最小限にし、瘢痕形成を低減する治療薬に主に焦点を当てています。しかし最近、パラダイムシフトが発生しました心の癒しと多くの研究努力を取り巻く思考に心臓再生4のための潜在的に注力してリダイレクトされています。
最近まで、心臓再生のin vivoでの研究は、このような有尾類両生類や硬骨魚5-7のものなどの非脊椎動物のモデルに限定されていました。心筋梗塞8,9を誘導するために、心尖部の切除および冠動脈閉塞ただし、新生仔マウスにおける心臓の再生のための能力の発見は、哺乳動物の心臓再生二外科的モデルの開発につながっています。 2011年には、マウス頂点切除モデルは、完全な心臓の再生が生後1日目（P1）で可能であることを実証するために使用されました。しかし、この容量は、初期新生児期の後に急速に低下します。哺乳類の心臓はまもなく前駆細胞数の減少などP7で出産後にその再生能力を失い、心筋細胞が二核となる、失いますそれらの増殖能力、および恒久的に細胞周期10,11を終了します。新生児と成人の哺乳類の心臓との間の基本的な違いを理解することは、心臓再生への新たな洞察につながる可能性があります。
頂点切除が実際に収縮性組織の再成長への洞察を提供していますが、モデルは、典型的なヒトの心臓の損傷をシミュレートしないため、治療薬の開発にも同様に向いていません。冠状動脈閉塞モデルは、しかしながら、より直接的MI病変の病態生理学的な側面をシミュレートし、したがって、ヒトへの使用のための治療の進歩にも適用可能である機構に多くの有用な洞察を提供してもよいです。
外科的冠状動脈結紮は、多くの動物モデル12-14に有用な実験手法として用いられてきました。成人の冠動脈結紮モデルでは、動物を麻酔し、respiratiを維持しながら、胸腔の開口を可能にするために挿管されていますに。心臓は冠状血管系の可視化を可能にし、正確な縫合糸の配置を考慮して、定期的に打つことを続けています。さらに灌流が続くように、心臓はピンクのままであり、連結後の虚血性心筋が成功した冠動脈結紮を示し、淡い表示されます。冠状動脈を可視化されておらず、外科医が縫合糸15を配置する場所を推定しなければならないので、新生児マウスのために記載されているプロトコルは、しかし、信頼性が低いです。冠血管系の一般的な解剖学は同じですが、LADの方向と分岐における個々の動物のばらつきが16存在します。 「ブラインドで行く、 "時したがって、動脈が簡単に見逃される可能性があります。例えば、心エコー検査などの他の技術は、その後、MIの成功した誘導を確認するために、すべての手術は、同様の梗塞サイズをもたらす確保する必要があります。 LADの位置がESTABすることができ、最近発表された方法15の改良は、ここにある説明しますlishedしたがって、LADを再現MIを誘導するために連結され得ます。
新生児マウスにおける低体温状態で開胸肺の崩壊を生じないように、この技術は、気管内挿管や人工呼吸器を必要としません。しかし、前述した方法では、重度の低体温は、完全無呼吸と心臓リズム15の停止の両方の点に誘導されなければなりません。このアプローチの主要な制限は、冠状動脈がもはや灌流されていることではないと心にもLAD結紮の前に淡い表示されます。本明細書に記載されたアプローチでは、冠状動脈の可視化は、手術後の新生児マウスの完全な回復と深い低体温や心臓リズム停止、前の無気力の時点で可能です。この方法では、100％の再現性の主な利点を提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書において実証外科的LAD結紮は、新生仔マウスにMIを生成するための信頼できる方法です。このモデルは、哺乳類の心臓の再生を研究すると再現性のモデルと研究者を提供します。冠動脈血管系の可視化は、正しい縫合糸の配置を確保するため、再現性を保証し、この方法の重要なコンポーネントです。成体マウスは、体温を変温能力を持たないおよび新生児マウスの代謝速度は密接?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by an operating grant from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) to Q.F. (grant #MOP-119600).
Materials
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice |
Riferimenti
- Rosamond, W., et al. Heart disease and stroke statistics–2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 117 (4), 25-146 (2008).
- . Meta-analysis Global Group in Chronic Heart Failure. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. Eur Heart J. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- D’Uva, G., et al. ERBB2 triggers mammalian heart regeneration by promoting cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nat Cell Biol. 17 (5), 627-638 (2015).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J Exp Zool. 187 (2), 249-253 (1974).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Haubner, B. J., et al. Complete cardiac regeneration in a mouse model of myocardial infarction. Aging. 4 (12), 966-977 (2012).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271, 2183-2189 (1996).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28 (8), 1737-1746 (1996).
- Feng, Q., et al. Elevation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in experimental congestive heart failure. Cardiovasc Res. 37 (3), 667-675 (1998).
- Xiang, F. L., et al. Cardiomyocyte-specific overexpression of human stem cell factor improves cardiac function and survival after myocardial infarction in mice. Circulation. 120 (12), 1065-1074 (2009).
- van Kats, J. P., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II type 1 receptor blockade prevent cardiac remodeling in pigs after myocardial infarction: role of tissue angiotensin II. Circulation. 102 (13), 1556-1563 (2000).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9 (2), 305-311 (2014).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Kao, W. W., Xia, Y., Liu, C. Y., Saika, S. Signaling pathways in morphogenesis of cornea and eyelid. Ocul Surf. 6 (1), 9-23 (2008).
- Redfors, B., Shao, Y. Z., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Experimental & Clinical Cardiology. 17 (4), 268-272 (2012).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38 (6), 887-890 (1986).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Mahmoud, A. I., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
