Myokardinfarkts bei neugeborenen Mäusen, ein Modell von Cardiac Regeneration

Summary

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Abstract

Myokardinfarkt durch Koronararterie induziert Ligierung wurde in vielen Tiermodellen als Werkzeug zur Untersuchung der Mechanismen der Herzwiederherstellung und Regeneration verwendet werden, und neue Ziele für Therapeutika zu definieren. Seit Jahrzehnten Modelle von kompletten Herzregeneration gab es in Amphibien und Fische, sondern ein Säugetier-Gegenstück war nicht verfügbar. Die jüngste Entdeckung eines postnatalen Fenster, während der Mäuse regenerative Fähigkeiten besitzen hat zur Einrichtung eines Säugetiermodell des Herzregeneration geführt. Ein chirurgisches Modell von Säugerherzregeneration in der Neugeborenen-Maus wird hier vorgestellt. Kurz gesagt, werden postnatalen Tag 1 (P1) Mäuse auf einem Eis-Pad von Isofluran und platziert narkotisiert Hypothermie zu induzieren. Nachdem die Brust geöffnet wird, und die linke vordere Koronararterie (LAD) abwärts visualisiert wird, wird eine Naht um die LAD zu platziert myokardiale Ischämie im linken Ventrikel zuzufügen. Der chirurgische Eingriff dauert 10-15 Minuten. Visualisierung der Koronararterievon entscheidender Bedeutung für die genaue Nahtplatzierung und Reproduzierbarkeit. Herzinfarkt und Herzfunktionsstörungen werden durch Triphenyl-Tetrazolium Chlorid (TTC) Färbung und Echokardiographie bzw. bestätigt. Vollständige Regeneration 21 Tage nach Myokardinfarkt durch Histologie bestätigt. Dieses Protokoll kann als ein Werkzeug verwendet werden Mechanismen von Säugerherzregeneration nach Myokardinfarkt aufzuklären.

Introduction

Myokardinfarkt (MI) ist eine führende Todesursache weltweit und bleibt für etwa ein Drittel der Herzinsuffizienz Fälle verantwortlich ^1. Während das Aufkommen der perkutanen Interventionen und kontinuierliche Optimierung der Verwendung von Thrombolytika tritt dennoch Reperfusion folgenden MI, cardiomyocyte Tod und Verlust kontraktiler Myokard erhöht. Es bleiben auch eine große Anzahl von "no-Option" Patienten, die keine Kandidaten für eine mehr oder nicht sehen, profitieren von diesen Maßnahmen. Diese Patienten weiterhin zu deaktivieren Ischämie zu erleben führende Bildung Narbe und schädlichen ventrikuläre Remodeling als Mechanismus der Infarktheilung. Dieser Prozess führt schließlich zu Herzversagen, für die Prognose trotz optimaler pharmakologischer Management mit Angiotensin-Converting-Enzym (ACE) Hemmer und Betablocker schlecht bleibt. Leider bleibt die Ein-Jahres-Sterblichkeit bei Patienten mit stark eingeschränkter linksventrikulärer Funktion noch alshoch wie 26% ^2. Herztransplantation ist die letzte Behandlungsmöglichkeit für Patienten mit Herzinsuffizienz. Allerdings ist der begrenzten Spender für eine Herztransplantation nicht für die meisten Patienten dies ein gangbarer Weg zu machen. Somit bleibt die Entdeckung neuer therapeutischer Mittel, die beschädigte Myokards zur Wiederherstellung von größter Bedeutung für die Herzkrankheit Problem zu lösen. Reliable Tiermodellen von Herzschäden werden daher als wichtige Komponente dieses Verfahrens erforderlich.

Traditionelle Dogma hat diktiert , dass adulte Kardiomyozyten sind post-mitotische, terminal differenzierte Zellen, unfähig , Dividieren oder De-Differenzierung des geschädigten Myokard ³ zu ersetzen. Als solche könnte ein erwachsener Säugetiere Herz nie vollständig von der Verletzung erholen und verloren Kardiomyozyten würde mit Fasergewebe ersetzt werden. So hat sich die Forschung konzentriert sich in erster Linie auf therapeutische Mittel Infarktausdehnung zu minimieren und die Narbenbildung zu verringern. vor kurzem jedoch mehr ist, hat ein Paradigmenwechsel stattgefundenHerzheilung und viele Forschungsanstrengungen im Denken umgebenden wurden auf das Potenzial für die Herzregeneration ⁴ zu konzentrieren umgeleitet.

Bis vor kurzem in vivo – Untersuchung von Herzregeneration wurde auf nicht-Vertebraten – Modelle beschränkt, wie sie in urodele Amphibien und Knochenfischen ^5-7. Allerdings hat die Entdeckung der Fähigkeit für die Herzregeneration in der neonatalen Maus zur Entwicklung von zwei chirurgischen Modelle von Säugerherzregeneration führte: Resektion der Herzspitze und der koronaren Arterienverschluss zu Myokardinfarkt ^8,9 induzieren. Im Jahr 2011 wurde eine Maus Spitze Resektion Modell, dass eine vollständige Herzregeneration möglich am postnatalen Tag 1 (P1) zu zeigen, verwendet. Allerdings sinkt diese Kapazität schnell nach der ersten Neugeborenenperiode. Das Säugetier-Herz seine regenerative Potenzial verliert kurz nach der Geburt bei P7 als Vorläuferzellzahlen sinken, und Kardiomyozyten binukleäre geworden, verlierenihre proliferative Kompetenz und permanent in den Zellzyklus ^10,11 verlassen. die grundlegenden Unterschiede zwischen dem Neugeborenen und Erwachsenen Säugetier-Herz Verstehen können neue Einblicke in die Herzregeneration führen.

Während in der Tat Spitze Resektion Einblick in erneute Wachstum von kontraktilen Gewebe bietet, so gilt das Modell nicht typisch menschliche Herzschädigung, zu simulieren und somit nicht selbst auf die Entwicklung von Therapeutika als auch nicht verleihen. Die Koronararterienokklusion Modell simuliert jedoch mehr direkt die pathophysiologischen Aspekte der MI Pathologie, und somit nützliche Einblicke in Mechanismen bereitzustellen, die zur Anwendung beim Menschen zu therapeutischen Fortschritt anwendbar sein können.

Chirurgische Koronarligatur wurde als nützliche experimentelle Technik in vielen Tiermodellen ^12-14 verwendet. Im Erwachsenen-Modell Koronararterienligatur werden die Tiere narkotisiert und intubiert Öffnung der Brusthöhle zu ermöglichen, während respirati Aufrechterhaltungauf. Das Herz weiterhin regelmäßig zu schlagen, ermöglicht die Visualisierung der Koronargefäße und die die präzise Nahtplatzierung. Darüber hinaus bleibt das Herz rosa als Perfusion weiter, und nach Ligatur der Myokard erscheint blass, was auf erfolgreiche Koronararterienligatur. Das Protokoll für neonatale Mäuse beschrieben, ist jedoch weniger zuverlässig als die Koronararterie nicht sichtbar gemacht wird , und der Chirurg muss schätzen , wo die Naht ¹⁵ zu platzieren. Obwohl die allgemeine Anatomie des koronaren Vaskulatur ist die gleiche, einzelne Tier – Variabilität in der Richtung und der Verzweigung der LAD ¹⁶ existiert. Wenn also "in erblinden", die Arterie leicht übersehen werden konnte. Andere Techniken wie Echokardiographie werden dann erforderlich erfolgreiche Induktion von MI zu bestätigen, und alle Operationen in ähnlicher Infarktgröße führen zu gewährleisten. Beschrieben wird hier eine Verbesserung gegenüber einer kürzlich veröffentlichten Verfahren ^15, wo die Position der LAD Estab werden kannfentlicht und damit LAD kann reproduzierbar ligiert werden, um MI induzieren.

Diese Technik erfordert keine Intubation oder mechanische Beatmung, wie Thorakotomie in einem hypothermischen Zustand in der Neugeborenen-Maus nicht zu einer Lungenkollaps. Jedoch in dem zuvor beschriebenen Verfahren, schwere Hypothermie muss bis zu dem Punkt sowohl vollständige Apnoe und Aufhören des Herzrhythmus ¹⁵ induziert werden. Die wesentliche Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass die Koronararterie nicht perfundierten länger und das Herz wird blaß noch bevor LAD Ligation. In dem beschriebenen Ansatz hier ist Koronararterie Visualisierung möglich an einem Punkt der Erstarrung vor tiefer Hypothermie und Herzrhythmus Aufhören mit voller Erholung der Neugeborenen Maus nach der Operation. Dieses Verfahren bietet einen großen Vorteil von 100% Reproduzierbarkeit.

Protocol

Brutpaare von C57BL / 6 und CD-1-IG-S-Mäuse wurden von Charles River erworben. Tiere in dieser Studie verwendet wurden, in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care behandelt und Studienprotokolle wurden durch den Einsatz von Tieren Subcommittee an der Western University, London, Kanada zugelassen. 1. Animal Care Nach Geburt abgeschlossen ist und Welpen haben für ein paar Stunden von ihrer Mutter zunächst gestillten gewesen, legen Sie sie in einem…

Representative Results

Der Myokardinfarkt Verfahren bei P1 in 10 abgeschlossen sein – 15 min und hat eine Mortalitätsrate von 7,8% (5 von 64 Welpen). Nach der Operation, Mäuse von hypothermen Anästhesie innerhalb der nächsten 5 erholen – 20 min (Zeit der Erholung hängt von der Körpertemperatur während der Anästhesie und die Geschwindigkeit des Chirurgen erreicht). Wenn P7 Welpen (zum Vergleich mit einer nicht-regenerativen Myokard), wird eine längere Kühlung erforderlich Torpor zu erreichen. P7 Welpe…

Discussion

Die chirurgische LAD Ligierung hierin gezeigt, ist eine zuverlässige Methode zur Herstellung von MI in neonatalen Mäusen. Dieses Modell bietet Forschern ein reproduzierbares Modell, mit dem Säuger-Herzregeneration zu studieren. Visualisierung der Koronargefäße ist ein wichtiger Bestandteil dieses Verfahrens korrekte Nahtplatzierung zu gewährleisten und damit die Reproduzierbarkeit gewährleistet. Während adulte Mäuse nicht poikilothermic Fähigkeiten besitzen, wird die Körpertemperatur und die Stoffwechselrate …

Materials

8-0 Nylon Suture	Microsurgery Instruments	8-0 Nylon
11-0 Nylon Suture	Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd	H1101
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-09
Small forceps	Fine Science Tools	11063-07
Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12060-02
Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope	Zeiss	300002
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Isoflurane Chamber	Made in Feng laboratory
Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC)	Sigma	T8877
Stereomicroscope SteREO Discovery. V8	Zeiss	435400
AxioVision 8.0	Zeiss
Axiocam Icc5	Zeiss	426554
Heat pad	Sunbeam	731A0-CN
Sterile Gloves	VWR	414004-430
Gauze Sponges	Ducare	90212
Ice