إعداد و<em> في فيفو</em> استخدام من التحقيق على أساس آخر ل<em> N</em> -acylethanolamine حمض أميداز
Summary
هنا، نحن تصف إعداد واستخدام مسبار على أساس النشاط (ARN14686، undec-10-ynyl- N – [(3 S) -2-oxoazetidin-3-YL] الكرباماتية) التي تسمح للكشف والقياس الكمي ل الشكل النشط من الانزيم proinflammatory N أميداز حمض -acylethanolamine (ناا)، سواء في المختبر والمجراة سابقا.
Abstract
على أساس النشاط التنميط البروتين (ABPP) هو وسيلة للتعرف على انزيم من الفائدة في بروتيوم معقدة من خلال استخدام مسبار الكيميائية التي تستهدف مواقع الإنزيم النشط. علامة مراسل أدخلت على التحقيق تسمح للكشف عن الإنزيم المسمى عن طريق المسح الضوئي في جل مضان، وصمة عار البروتين، المجهري مضان، أو السائل الطيف اللوني الشامل. هنا، نحن تصف إعداد واستخدام ARN14686 المجمع، تحقيقا على أساس النشاط بنقرة والكيمياء (CC-برنامج الجسر الأكاديمي) أن تعترف بشكل انتقائي الانزيم N أميداز حمض -acylethanolamine (ناا). ناا هو هيدرولاز السيستين الذي يعزز الالتهاب عن طريق إلغاء تنشيط مستقبلات الذاتية تنشيط ناشر-بيروكسية (PPAR) منبهات -alpha مثل palmitoylethanolamide (PEA) وoleoylethanolamide (أويا). ويتم تصنيع ناا باعتبارها proenzyme كامل طول الخاملة، التي يتم تفعيلها من خلال تحلل بروتيني ذاتي في درجة الحموضة الحامضية لليحلول. دراسات الترجمة حافي أظهرت أن ناا وأعرب في الغالب في الضامة وغيرها من الخلايا المشتقة الوحيدات، وكذلك في B-الخلايا الليمفاوية. نحن نقدم أمثلة على الكيفية التي يمكن أن تستخدم ARN14686 لكشف وتحديد نشط ناا فيفو السابقين في أنسجة القوارض لطخة البروتين والفحص المجهري مضان.
Introduction
يشيع استخدامها أساليب للتحقيق في أنماط التعبير، والتفاعلات، وظائف البروتينات، بما في ذلك منصات الطيف اللوني الشامل السائل لتحليل طلقات نارية 1،2، الخميرة أساليب اثنين هجينة 3،4، وفي فحوصات المختبر، تقتصر في أن تكون غير قادر على تقييم نشاط البروتينات في حالتها الأصلية. على أساس النشاط بروتين التنميط (ABPP) يمكن استخدامها لملء هذه الفجوة. في هذا النهج، جزيء صغير يسبر قادرة على ملزمة تساهميا إلى موقع نشط من انزيم من الفائدة مترافق إلى مجموعة المراسل أن يسمح للكشف عن الهدف. عن طريق النقر الكيمياء (CC)، لمراسل ويمكن دمجها في التحقيق أو يمكن إدخال بعد الاشتباك الهدف حدث 5،6. يتطلب الإجراء الأخير استخدام المجسات التي تحتوي على مجموعات كيميائية مناسبة، مثل آلكاين محطة أو أزيد، والتي يمكن تعديلها مع عدد من الكواشف مراسل عبر التفاعلات الحيوية متعامد يمثح باسم النحاس (I) -catalyzed Huisgen [3 + 2] cycloaddition 7-9 أو شتاودينغر ربط 10،11.
في الآونة الأخيرة، ونحن الكشف عن ARN14686 مركب مثل برنامج الجسر الأكاديمي الأول للفي التجارب المختبرية وكشف الجسم الحي من هيدرولاز السيستين، ناا 12. ناا يحفز التعطيل حلمهي من القوات المسلحة المشبعة وغير المشبعة الاحادية، بما في ذلك oleoylethanolamide (أويا) وpalmitoylethanolamide (PEA)، والتي هي محفزات الذاتية للالمضادة للالتهابات مستقبل نووي PPAR ألفا 13-15. وأعرب عن ناا في الغالب في الضامة وغيرها من الخلايا المشتقة الوحيدات، وكذلك في B-الخلايا الليمفاوية 14،16، مما يشير إلى دور في تنظيم الاستجابة المناعية الفطرية. يتم تصنيعه الانزيم في الشبكة الإندوبلازمية الخام في شكل غير نشط ويتم تنشيط في مقصورات الحمضية من الخلية بواسطة آلية autoproteolytic 17. الانقسام autoproteolytic يولد N السيستين -terminal الجديدة (C131 في الفئران والجرذان، C126 في البشر)، وهذا هو المسؤول النيوكليوفيل لFAE التحلل 18،19. تثبيط الدوائية النشاط ناا يغير FAE التوازن التوليف / تدهور لصالح زيادة مستويات الخلايا من القوات المسلحة 16،20،21. وقد ثبت عدة β-اكتون وβ لاكتام المشتقات لكبح النشاط ناا مع قوة عالية والانتقائية 16،22-26. هذه المثبطات تعمل من خلال S -acylation من السيستين الحفازة 16،27،28.
تم تصميم ARN14686 مركب على أساس التركيب الكيميائي للالنشطة للنظام، المستمدة سيرين β لاكتام ناا المانع، ARN726 (4 cyclohexylbutyl- N – [(S) -2-oxoazetidin-3-YL] الكرباماتية) 16. تم استبدال مجموعة 4-بوتيل cyclohexyl من ARN726 مع سلسلة الأليفاتية المشبعة C9 تحمل علامة آلكاين محطة لتصريف CC لاحق مع علامة مراسل أزيد الحمل. لقد اخترنا لتصميم برنامج الجسر الأكاديمي من خطوتين لminimallذ تغيير هيكل السقالة الأصلية، وبالتالي الحفاظ على تقارب لجنة التحقيق لناا. وعلاوة على ذلك، وتجنب إدخال علامات ضخمة، يمكن لمثل هذا التحقيق أن يكون أكثر مناسبة لتلقي العلاج في الجسم الحي من برنامج الجسر الأكاديمي المباشر. ARN14686 يمنع ناا مع قوة عالية (hNAAA IC 50 = 6 نيوتن متر، rNAAA IC 50 = 13 نانومتر) من خلال تشكيل ناتج إضافة التساهمية مع السيستين الحفاز للانزيم 12. وأظهرت التجارب على الفئران الحية أن التحقيق هو انتقائية في التقاط أعرب ناا في الرئتين. وقد تم تحديد حمض سيراميداز، أميداز السيستين آخر يتقاسم الهوية 33-34٪ مع ناا، أيضا كهدف تقارب منخفضة عند استخدام تركيزات عالية من التحقيق (10 ميكرومتر في المختبر، 10 ملغ / مل في الوريد، والرابع) 12. وقد استخدمنا أيضا ARN14686 لدراسة وجود ناا فعال في أنسجة الفئران الملتهبة التالية إدارة مساعد الكامل فرويند (CFA) 29.
هنا، ونحن الخطوط العريضة لبروتوكول لpreparatiعلى من ARN14686 (الشكل 1) وتطبيقه على التحقيق في تفعيل ناا خارج الحي. وكمثال على ذلك، نحن تصف الإجراء التجريبي لتصور ناا في الكفوف الفئران بعد تناوله CFA. في هذه التجربة، يتم استخراج البروتينات من الأنسجة مخلب بعد حقن الرابع لجنة التحقيق، ويتعرض بروتيوم المسمى برنامج الجسر الأكاديمي إلى CC مع البيوتين أزيد. يتم إثراء عينات المعقدة البيروكسيديز باستخدام الخرز streptavidin، ويتم تنفيذ البقع البروتين. في تطبيق آخر، وصفنا توطين ناا نشط بواسطة المجهر مضان في الرئتين الماوس من الفئران المعالجة التحقيق. في هذه الحالة، يتم مقطوع الأنسجة ويتعرضون أقسام إلى CC لإضافة رودامين. ويتضح مخطط سير العمل في الشكل 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
وينظم نشاط انزيم بدقة على مختلف المستويات، بما في ذلك النسخ RNA، تخليق البروتين، النبات البروتين، وتعديل ما بعد متعدية، وتفاعل البروتين البروتين. في كثير من الأحيان، والتعبير انزيم وحده لا يفسر لنشاطها. وقد وضعت ABPP لدراسة نشاط البروتينات في حالتها الأصلية. مطلوبة سمت…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Nikon Imaging Center at Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italy (NIC@IIT).
Materials
| 1,1’-sulfonyldiimidazole | Sigma Aldrich | 367818 | Harmful |
| 2-dipyridylcarbonate | Fluorochem | 11331 | Harmful |
| 2-Methylbutan | Sigma Aldrich | M32631 | Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment |
| 4-(Dimethylamino)pyridine | Sigma Aldrich | 107700 | Toxic |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | Flammable, Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | Flammable, Toxic |
| Activated charcoal | Sigma Aldrich | 161551 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | Harmful |
| Azide-PEG3-Biotin | Jena Biosciences | CLK-AZ104P4 | |
| Azide-PEG3-Fluor 545 | Jena Biosciences | CLK-AZ109 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Blocking buffer | Li-Cor Biosciences | 927-40000 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | Higly toxic |
| Bovin serum albumine (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | B0126 | |
| Bruker Avance III 400 | Bruker | ||
| Celite | Sigma Aldrich | 419931 | Health hazard |
| Ceric ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 22249 | Oxidizing, Harmful |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich | C8383 | Higly toxic |
| CuSO4.5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Toxic |
| Cyclohexadiene | Sigma Aldrich | 125415 | Flammable, Health hazard |
| Cyclohexane | Sigma Aldrich | 34855 | Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 34856 | Harmful, Health hazard |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | Flammable, Harmful |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Acros Organics | 348441000 | |
| Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) | Sigma Aldrich | 175943 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | Flammable, Harmful |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 34858 | Flammable, Harmful |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Irdye 680-LT Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-68031 | |
| IRDye680-LT Streptavidin | Licor | 925-68031 | Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34966 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Flammable, Toxic, Health hazard |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E7750 | Harmful, Corrosive |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | Flammable, Corrosive, Toxic |
| N,N-dimethylformamide | Sigma Aldrich | 227056 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| N-Cbz-L-Serine | Fluorochem | M03053 | Harmful |
| Nikon A1 confocal microscopy | Nikon | Read the user manual | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | |
| Palladium on carbon | Sigma Aldrich | 330108 | |
| p-anisidine | Sigma Aldrich | A88255 | Toxic, Health hazard, Environmental hazard |
| Paraformaldehyde | sigma Aldrich | 441244 | Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | P3265 | |
| ProLong Gold antifade mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | Avoid bubbles formation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Toxic, corrosive, falmmable |
| Sodium hydride | Sigma Aldrich | 452912 | Flammable |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | |
| Starion FLA-9000 immage scanner | FUJIFILM | Read the user manual | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20349 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Tert-butanol | Sigma Aldrich | 360538 | Toxic, flammable |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 186562 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| Thiourea | Acros Organics | 424542500 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
| Tris | Sigma Aldrich | RDD008 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| Triton-x100 | Sigma Aldrich | X100 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer | IKA | ||
| Undec-10-yn-1-ol | Fluorochem | 13739 | Harmful |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
Riferimenti
- Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
- Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
- Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
- Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
- Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
- Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
- Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
- Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
- Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
- Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
- Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
- Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
- Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
- Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
- West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
- Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
- Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
- Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
- Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
- Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
- Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
- Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
- Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
- Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
- Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund’s Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
- Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
- Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
- Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
- Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).
