подготовки и<em> В Vivo</em> Использование тестовое активность на основе для<em> N</em> -acylethanolamine Кислота амидазные
Summary
Здесь мы описываем получение и использование одного из видов деятельности на основе зонда (ARN14686, ундец-10-ynyl- N – [(3 S) -2-оксоазетидин-3-ил] карбамат) , что позволяет обнаруживать и количественное активная форма фермента провоспалительных N амидазы -acylethanolamine кислоты (NAAA), как в пробирке и экс естественных условиях.
Abstract
Деятельность на основе белка профилирование (ABPP) представляет собой способ идентификации фермента интерес в сложном протеома за счет использования химического зонда, который нацелен активных участков фермента. Репортер тег введен в зонд позволяет для обнаружения меченого фермента в геле сканирования флуоресценции, белка-блот, флуоресцентной микроскопии, или жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. Здесь мы опишем приготовление и применение соединения ARN14686, химии кликах на основе зонда (CC-ABP) , который селективно распознает фермент N амидазу -acylethanolamine кислоты (Naaa). NAAA представляет собой цистеин гидролазная, что способствует воспаление деактивируя эндогенные активатора пролиферации пероксисом рецептора (PPAR) -альфа агонисты, такие как пальмитоилэтаноламид (ПЭА) и oleoylethanolamide (OEA). NAAA синтезируется как неактивный полнометражного профермента, который активируется autoproteolysis в кислом рН лизосом. Локализация исследования чпр показано, что NAAA преимущественно экспрессируется в макрофагах и других моноцитарных клеток, а также в В-лимфоцитов. Мы приводим примеры того , как ARN14686 могут быть использованы для обнаружения и количественного определения активного Naaa исключая виво в тканях грызунов с помощью белков – блоттинга и флуоресцентной микроскопии.
Introduction
Обычно используемые методы для изучения паттернов экспрессии, взаимодействия и функции белков, в том числе для жидкостной хроматографии-масс – спектрометрии платформ для анализа дробовика 1,2, дрожжи двух гибридных методов 3,4, а в анализах пробирке, ограничены в том , что они не в состоянии оценить активность белков в их нативном состоянии. Деятельность на основе белка профилирование (ABPP) может быть использован, чтобы заполнить этот пробел. При таком подходе, малые молекулы зондов способна ковалентного связывания с активным участком фермента, представляющего интерес, конъюгированного с репортером группы, что позволяет обнаруживать мишени. С помощью химии щелчок (CC), репортер может быть встроен в зонд или может быть введен после того, как поражение цели произошло 5,6. Последняя процедура требует использования зондов, содержащих соответствующие химические группы, такие как терминальное алкина или азида, который может быть модифицирован с рядом репортерных реагентов с помощью био-ортогональный реакций SUCч как Cu (I) -catalyzed Huisgen [3 + 2] циклоприсоединения 7-9 или Штаудингер лигирование 10,11.
Недавно мы раскрыли соединение ARN14686 в качестве первого АВР для в пробирке и в естественных условиях обнаружения цистеина гидролазы, Naaa 12. NAAA катализирует гидролитическое дезактивацию насыщенных и мононенасыщенных Faes, включая oleoylethanolamide (OEA) и пальмитоилэтаноламид (ПЭА), которые являются эндогенными агонистами противовоспалительного ядерных рецепторов PPAR-альфа 13-15. NAAA преимущественно экспрессируется в макрофагах и других моноцитарных клеток, а также в В-лимфоцитов 14,16, что указывает на роль в регуляции врожденной иммунной реакции. Фермент синтезируется в шероховатой эндоплазматической сети в неактивной форме и активируется в кислой отсеках клетки с помощью autoproteolytic механизма 17. Autoproteolytic расщепления генерирует новый N – терминальном цистеин (C131 у мышей и крыс, C126 в организме человека), который является ответственным за нуклеофил FAE гидролиз 18,19. Фармакологическое ингибирование активности Naaa изменяет FAE баланс синтеза / деградации в пользу увеличения клеточных уровней Faes 16,20,21. Несколько производных β-лактон и β-лактамные было показано ингибировать активность Naaa с высокой активностью и селективностью 16,22-26. Эти ингибиторы действуют через S -acylation каталитического цистеина 16,27,28.
Соединение ARN14686 был разработан на основе химической структуры активного системно, серин полученный ингибитор β-лактамным Naaa, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N – [(S) -2-оксоазетидин-3-ил] карбамата) 16. 4-бутил-циклогексил группа ARN726 была заменена С9 насыщенной алифатической цепи, несущего концевой алкиновой метку для последующего CC конъюгации с репортером меткой азид-подшипника. Мы решили разработать двухступенчатую АВР для minimallY изменяют структуру исходного помост, сохраняя тем самым сродство зонда для Naaa. К тому же , избегая введения громоздких тегов, такой зонд может быть более подходящим для лечения в естественных условиях , чем прямое АБП. ARN14686 ингибирует Naaa с высокой активностью (hNAAA IC 50 = 6 нМ, rNAAA IC 50 = 13 нМ) путем образования ковалентной аддукта с каталитической цистеина фермента 12. Эксперименты в живых крысах показали, что зонд является селективным в захвате NAAA выражается в легких. Кислота ceramidase, еще один цистеин амидазы , который разделяет 33-34% идентичность с Naaa, также был идентифицирован как мишень с низкой аффинности при использовании высоких концентраций зонда (10 мкМ в пробирке, 10 мг / мл для внутривенного введения, внутривенно) 12. Мы также использовали ARN14686 изучить наличие активного Naaa в воспаленных тканях крыс после введения адъюванта Фрейнда (CFA) 29.
Здесь мы приводим протокол для препаратов в базе данныхна из ARN14686 (рисунок 1) и его применение к исследованию активации Naaa экс естественных условиях. В качестве примера, мы опишем экспериментальную процедуру визуализации Naaa в лапы крыс после введения CFA. В этом эксперименте белки извлекают из ткани лапы после инъекции зонда, и АБП-меченых протеом подвергают КХ с биотин-азида. Биотинилированные образцы обогащены с использованием стрептавидином бусинки, и белковые кляксы выполняются. В другом приложении мы описываем локализацию активного Naaa с помощью флуоресцентной микроскопии в легких мышей из зондовых обработанных мышей. В этом случае ткань секционного и секции подвергаются CC для родамина дополнение. Схема рабочего процесса показана на рисунке 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ферментативная активность тонко регулируется на различных уровнях, в том числе транскрипции РНК, синтез белка, транслокация белка, пост-трансляционной модификации и белок-белковых взаимодействий. Часто, экспрессия фермента в одиночку не учитывает его деятельности. ABPP была разработан…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Nikon Imaging Center at Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italy (NIC@IIT).
Materials
| 1,1’-sulfonyldiimidazole | Sigma Aldrich | 367818 | Harmful |
| 2-dipyridylcarbonate | Fluorochem | 11331 | Harmful |
| 2-Methylbutan | Sigma Aldrich | M32631 | Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment |
| 4-(Dimethylamino)pyridine | Sigma Aldrich | 107700 | Toxic |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | Flammable, Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | Flammable, Toxic |
| Activated charcoal | Sigma Aldrich | 161551 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | Harmful |
| Azide-PEG3-Biotin | Jena Biosciences | CLK-AZ104P4 | |
| Azide-PEG3-Fluor 545 | Jena Biosciences | CLK-AZ109 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Blocking buffer | Li-Cor Biosciences | 927-40000 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | Higly toxic |
| Bovin serum albumine (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | B0126 | |
| Bruker Avance III 400 | Bruker | ||
| Celite | Sigma Aldrich | 419931 | Health hazard |
| Ceric ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 22249 | Oxidizing, Harmful |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich | C8383 | Higly toxic |
| CuSO4.5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Toxic |
| Cyclohexadiene | Sigma Aldrich | 125415 | Flammable, Health hazard |
| Cyclohexane | Sigma Aldrich | 34855 | Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 34856 | Harmful, Health hazard |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | Flammable, Harmful |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Acros Organics | 348441000 | |
| Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) | Sigma Aldrich | 175943 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | Flammable, Harmful |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 34858 | Flammable, Harmful |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Irdye 680-LT Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-68031 | |
| IRDye680-LT Streptavidin | Licor | 925-68031 | Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34966 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Flammable, Toxic, Health hazard |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E7750 | Harmful, Corrosive |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | Flammable, Corrosive, Toxic |
| N,N-dimethylformamide | Sigma Aldrich | 227056 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| N-Cbz-L-Serine | Fluorochem | M03053 | Harmful |
| Nikon A1 confocal microscopy | Nikon | Read the user manual | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | |
| Palladium on carbon | Sigma Aldrich | 330108 | |
| p-anisidine | Sigma Aldrich | A88255 | Toxic, Health hazard, Environmental hazard |
| Paraformaldehyde | sigma Aldrich | 441244 | Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | P3265 | |
| ProLong Gold antifade mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | Avoid bubbles formation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Toxic, corrosive, falmmable |
| Sodium hydride | Sigma Aldrich | 452912 | Flammable |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | |
| Starion FLA-9000 immage scanner | FUJIFILM | Read the user manual | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20349 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Tert-butanol | Sigma Aldrich | 360538 | Toxic, flammable |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 186562 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| Thiourea | Acros Organics | 424542500 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
| Tris | Sigma Aldrich | RDD008 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| Triton-x100 | Sigma Aldrich | X100 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer | IKA | ||
| Undec-10-yn-1-ol | Fluorochem | 13739 | Harmful |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
Riferimenti
- Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
- Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
- Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
- Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
- Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
- Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
- Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
- Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
- Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
- Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
- Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
- Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
- Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
- Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
- West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
- Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
- Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
- Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
- Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
- Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
- Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
- Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
- Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
- Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
- Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund’s Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
- Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
- Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
- Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
- Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).
