Vorbereitung und<em> In Vivo</em> Die Verwendung eines aktivitätsbasierte Sonde für<em> N</em> -acylethanolamine Säure Amidase
Summary
Hier beschreiben wir die Herstellung und Verwendung eines aktivitätsbasierten Sonde (ARN14686, undec-10-ynyl- N – [(3 S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamat) , die zum Nachweis und zur Quantifizierung des ermöglicht aktive Form des proinflammatorischen Enzym N -acylethanolamine Säure Amidase (NAAA), sowohl in vitro und ex vivo.
Abstract
Aktivitätsbasierte Protein Profilierung (ABPP) ist ein Verfahren zur Identifizierung eines Enzyms von Interesse in einer komplexen Proteom durch die Verwendung einer chemischen Sonde, die das Enzym der aktiven Stellen richtet. Ein Reporter-Tag in die Sonde eingeführt ermöglicht die Detektion des markierten Enzyms durch in-Gel-Fluoreszenz-Scanning, Protein-Blot, Fluoreszenz-Mikroskopie, oder Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie. Hier beschreiben wir die Herstellung und die Verwendung der Verbindung ARN14686, eine Click – Chemie aktivitätsbasierte Sonde (CC-ABP), die das Enzym N -acylethanolamine Säure Amidase selektiv erkennt (NAAA). NAAA ist ein Cystein-Hydrolase, die Entzündung durch Deaktivierung endogenen Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptor (PPAR) -alpha-Agonisten wie Palmitoylethanolamide (PEA) und oleoylethanolamide (OEA) fördert. NAAA wird als inaktives Proenzym in voller Länge synthetisiert, die durch Autoproteolyse in dem sauren pH des Lysosom aktiviert wird. Lokalisationsstudien have gezeigt, dass NAAA überwiegend in Makrophagen und anderen Monozyten abgeleiteten Zellen exprimiert wird, als auch in B-Lymphozyten. Wir stellen Beispiele dafür , wie ARN14686 verwendet werden können , zu erkennen und zu aktiven NAAA ex vivo in Nagetiergeweben durch Protein – Blot und Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert.
Introduction
Üblicherweise Methoden verwendet , um die Expressionsmuster, Interaktionen und Funktionen von Proteinen zu untersuchen, einschließlich Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie Plattformen für shotgun Analyse 1,2, Hefe – Zwei-Hybrid – Verfahren 3,4 und in vitro – Assays sind in begrenzt , dass sie nicht in der Lage, die Aktivität der Proteine in ihrem nativen Zustand zu beurteilen. Die aktivitätsbasierte Proteinprofilierung (ABPP) können verwendet werden, um diese Lücke zu füllen. In diesem Ansatz werden die Sonden mit kleinem Molekül, das an die aktive Stelle eines Enzyms von Interesse konjugiert an eine Reportergruppe kovalent Bindung, die für die Zielerfassung ermöglicht. Mit Klick – Chemie (CC), kann der Reporter in die Sonde integriert oder eingeführt werden , nachdem Ziel Engagement 5,6 aufgetreten ist. Das letztere Verfahren erfordert die Verwendung von Sonden geeigneten chemischen Gruppen, wie beispielsweise einem terminalen Alkin oder Azid, die mit einer Anzahl von Reporterreagenzien über bioorthogonalen Reaktionen modifiziert werden kann such als Cu (I) -katalysierte Huisgen [3 + 2] -Cycloaddition 7-9 oder Staudinger – Ligation 10,11.
Vor kurzem offenbarten wir die Verbindung ARN14686 als erste ABP für die di – vitro- und di – vivo – Nachweis der Cystein – Hydrolase, NAAA 12. NAAA katalysiert die hydrolytische Deaktivierung von gesättigten und einfach ungesättigten FAEs, einschließlich oleoylethanolamide (OEA) und Palmitoylethanolamid (PEA), die 13-15 endogene Agonisten des anti-inflammatory nukleären Rezeptor PPAR-alpha sind. NAAA wird überwiegend in Makrophagen und anderen Monozyten abgeleiteten Zellen exprimiert werden , als auch in B-Lymphozyten 14,16, eine Rolle in der Regulation der angeborenen Immunantwort hinweist. Das Enzym wird im rauhen endoplasmatischen Retikulum in einer inaktiven Form synthetisiert und in sauren Kompartimenten der Zelle durch eine autoproteolytische Mechanismus 17 aktiviert. Die autoproteolytische Spaltung erzeugt ein neues N -terminale Cystein (C131 in Mäusen und Ratten, C126 beim Menschen), das heißt das Nukleophil für FAE 18,19 Hydrolyse. Pharmakologische Hemmung der NAAA Aktivität verändert die FAE – Synthese / Abbau Gleichgewicht zugunsten der erhöhten zellulären Ebenen der FAE 16,20,21. Mehrere β-lacton und β-Lactam – Derivate wurden 16,22-26 NAAA Aktivität mit hoher Wirksamkeit und Selektivität gezeigt , zu hemmen. Diese Inhibitoren wirken durch S – Acylierung des katalytischen Cystein 16,27,28.
(- [(S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamat 4-cyclohexylbutyl- N) 16 Die Verbindung ARN14686 wurde basierend auf der chemischen Struktur des systemisch aktiven, Serin abgeleiteten β-Lactam NAAA Inhibitor, ARN726 gestaltet. Das 4-Butyl-cyclohexyl Gruppe von ARN726 wurde mit einem C9 gesättigte aliphatische Kette ersetzt ein terminales Alkin-Tag für die nachfolgende CC Konjugation mit einem Azid-Lager Reporter-Tag trägt. Wir entschieden uns für einen zweistufigen ABP-Design, um minimally die Struktur des ursprünglichen Gerüsts verändert, wodurch die Affinität der Sonde für NAAA aufrechterhalten wird. Darüber hinaus die Einführung von sperrigen Tags zu vermeiden, eine solche Sonde könnte besser geeignet sein für in vivo – Behandlung als eine direkte ABP. ARN14686 hemmt NAAA mit hoher Potenz (hNAAA IC 50 = 6 nM, rNAAA IC 50 = 13 nM) durch eine kovalente Addukt mit dem katalytischen Cystein des Enzyms 12 bilden. Experimente mit lebenden Ratten zeigten, dass die Sonde bei der Erfassung von NAAA selektiv ist in Lunge ausgedrückt. Acid Ceramidase, eine andere Cystein – Amidase , die 33-34% Identität mit NAAA teilt, wurde auch als niedriger Affinität Ziel identifiziert , wenn eine hohe Sondenkonzentrationen (10 & mgr; M in vitro, 10 mg / ml intravenös, iv) unter Verwendung von 12. Wir haben auch ARN14686 zur Untersuchung der Anwesenheit von aktiven NAAA in entzündeten Rattengeweben nach der Verabreichung von komplettem Freund'schen Adjuvans (CFA) 29 verwendet.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die preparatiauf der ARN14686 (Abbildung 1) und ihre Anwendung auf die Untersuchung von NAAA Aktivierung ex vivo. Als Beispiel beschreiben wir ein experimentelles Verfahren NAAA visualisieren in Rattenpfoten nach CFA Verabreichung. In diesem Experiment werden die Proteine aus paw Gewebe nach intravenöser Injektion der Sonde extrahiert und die ABP-markiertem Proteom unterzogen mit Biotin-Azid zu CC. Biotinylierte Proben werden unter Verwendung von Streptavidin-Kügelchen angereichert, und Protein-Blots durchgeführt werden. In einer anderen Anwendung beschreiben wir die Lokalisation der aktiven NAAA durch Fluoreszenzmikroskopie in Mauslungen von der Sonde behandelten Mäusen. In diesem Fall wird das Gewebe geschnitten und Abschnitte sind CC für Rhodamin-Addition unterzogen. Ein Workflow – Schema ist in Abbildung 2 dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Enzymaktivität wird auf verschiedenen Ebenen fein reguliert, einschließlich RNA-Transkription, Proteinsynthese, Protein Translokation, post-translationale Modifikation und Protein-Protein-Wechselwirkung. Oft allein Enzym-Expression nicht für seine Tätigkeit ausmachen. ABPP wurde die Aktivität von Proteinen in ihrem nativen Zustand zu studieren entwickelt. Zwei Merkmale sind erforderlich: eine chemische Sonde, die kovalent bindet an die aktive Stelle eines Enzyms von Interesse und einem Reporter-Tag die Sonde-ma…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Nikon Imaging Center at Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italy (NIC@IIT).
Materials
| 1,1’-sulfonyldiimidazole | Sigma Aldrich | 367818 | Harmful |
| 2-dipyridylcarbonate | Fluorochem | 11331 | Harmful |
| 2-Methylbutan | Sigma Aldrich | M32631 | Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment |
| 4-(Dimethylamino)pyridine | Sigma Aldrich | 107700 | Toxic |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | Flammable, Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | Flammable, Toxic |
| Activated charcoal | Sigma Aldrich | 161551 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | Harmful |
| Azide-PEG3-Biotin | Jena Biosciences | CLK-AZ104P4 | |
| Azide-PEG3-Fluor 545 | Jena Biosciences | CLK-AZ109 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Blocking buffer | Li-Cor Biosciences | 927-40000 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | Higly toxic |
| Bovin serum albumine (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | B0126 | |
| Bruker Avance III 400 | Bruker | ||
| Celite | Sigma Aldrich | 419931 | Health hazard |
| Ceric ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 22249 | Oxidizing, Harmful |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich | C8383 | Higly toxic |
| CuSO4.5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Toxic |
| Cyclohexadiene | Sigma Aldrich | 125415 | Flammable, Health hazard |
| Cyclohexane | Sigma Aldrich | 34855 | Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 34856 | Harmful, Health hazard |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | Flammable, Harmful |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Acros Organics | 348441000 | |
| Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) | Sigma Aldrich | 175943 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | Flammable, Harmful |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 34858 | Flammable, Harmful |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Irdye 680-LT Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-68031 | |
| IRDye680-LT Streptavidin | Licor | 925-68031 | Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34966 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Flammable, Toxic, Health hazard |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E7750 | Harmful, Corrosive |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | Flammable, Corrosive, Toxic |
| N,N-dimethylformamide | Sigma Aldrich | 227056 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| N-Cbz-L-Serine | Fluorochem | M03053 | Harmful |
| Nikon A1 confocal microscopy | Nikon | Read the user manual | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | |
| Palladium on carbon | Sigma Aldrich | 330108 | |
| p-anisidine | Sigma Aldrich | A88255 | Toxic, Health hazard, Environmental hazard |
| Paraformaldehyde | sigma Aldrich | 441244 | Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | P3265 | |
| ProLong Gold antifade mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | Avoid bubbles formation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Toxic, corrosive, falmmable |
| Sodium hydride | Sigma Aldrich | 452912 | Flammable |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | |
| Starion FLA-9000 immage scanner | FUJIFILM | Read the user manual | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20349 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Tert-butanol | Sigma Aldrich | 360538 | Toxic, flammable |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 186562 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| Thiourea | Acros Organics | 424542500 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
| Tris | Sigma Aldrich | RDD008 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| Triton-x100 | Sigma Aldrich | X100 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer | IKA | ||
| Undec-10-yn-1-ol | Fluorochem | 13739 | Harmful |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
Riferimenti
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