調製と<em>インビボ</em>アクティビティベースのプローブの使用のために<em> N</em> -acylethanolamine酸アミダーゼ
Summary
ここでは、アクティビティベースのプローブの調製および使用を記載する（ARN14686、ウンデカ-10- ynyl- N – [（3 S）-2-オキソアゼチジン-3-イル]カルバメート）の検出および定量を可能にします前炎症性酵素Nの活性形態は、in vitroおよびex vivoの両方、酸アミダーゼ（NAAA）を-acylethanolamine。
Abstract
活性に基づくタンパク質プロファイリング（ABPP）は、酵素の活性部位を標的とする化学的プローブの使用を介して複雑なプロテオームにおける目的の酵素を同定するための方法です。プローブに導入されたレポータータグは、ゲル内蛍光スキャニング、タンパク質ブロット、蛍光顕微鏡、または液体クロマトグラフィー – 質量分析法による酵素標識の検出を可能にします。ここでは、化合物のARN14686、選択的にNが酸アミダーゼ（NAAA）を-acylethanolamine酵素を認識し、クリックケミストリーアクティビティベースのプローブ（CC-ABP）の製造および使用を記載します。 NAAAは、パルミトイルエタノールアミド（PEA）及びオレオイルエタノールアミド（OEA）などの内因性ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR） – アルファアゴニストを非活性化することによって炎症を促進するシステイン加水分解酵素です。 NAAAは、リソソームの酸性pHで自己タンパク質分解によって活性化される不活性な完全長プロ酵素として合成されます。ローカリゼーション研究の時間AVEは、NAAAは、主にマクロファージおよび他の単球由来細胞における、並びにBリンパ球で発現されることを示します。我々はARN14686タンパク質ブロット、蛍光顕微鏡によりげっ歯類組織において活性NAAA エクスビボの検出および定量化するために使用できる方法の例を提供します。
Introduction
一般的に使用される発現パターン、相互作用、及びショットガン分析1,2のための液体クロマトグラフィー-質量分析プラットフォームを含むタンパク質の機能を調査する方法、酵母ツーハイブリッド法3,4、およびインビトロアッセイにおいて 、それらがあることで制限されていますその天然の状態でタンパク質の活性を評価することができません。活性に基づくタンパク質プロファイリング（ABPP）は、このギャップを埋めるために使用することができます。このアプローチでは、共有結合的に目的の酵素の活性部位に結合することができる小分子プローブは、標的検出を可能にするレポーター基に結合しています。クリックケミストリー（CC）を使用して、レポータープローブに組み込むことができ、または標的係合5,6を発生した後に導入することができます。後者の手順は、SUCバイオ直交反応を介してレポーター試薬の数に変更することができ、そのような末端アルキンまたはアジドなどの適切な化学基を含有するプローブの使用を必要としますCu（I）などのhはヒュイゲン[3 + 2]環7-9またはシュタウディンガーライゲーション10,11 -触媒。
最近、我々は、in vitroでの最初のABPとしてシステイン加水分解酵素、NAAA 12のインビボでの検出中の化合物ARN14686を開示しました。 NAAAは、抗炎症性核内受容体PPAR-α13-15の内因性アゴニストであるオレオイルエタノールアミド（OEA）とパルミトイルエタノールアミド（PEA）を含む飽和および一価不飽和のFAE、の加水分解不活性化を触媒します。 NAAAは、主に先天性免疫応答の調節における役割を示唆し、ならびにBリンパ球14,16のように、マクロファージおよび他の単球由来細胞において発現されます。酵素は不活性型の粗面小胞体で合成され、自己タンパク質分解機構17によって、細胞の酸性区画において活性化されます。自己タンパク質分解切断は、新しいN末端システイン（C13を生成し、マウスおよびラットにおける1、ヒトにおけるC126）、すなわちFAE加水分解18,19のための求核責任があります。 NAAA活性の薬理学的阻害は、のFAE 16,20,21の増加細胞レベルの賛成でFAE合成/分解のバランスを変化させます。いくつかのβラクトンおよびβラクタム誘導体は高い効力および選択16,22-26でNAAA活性を阻害することが示されています。これらの阻害剤は、触媒システイン16,27,28 のS -acylationを介して作用します。
（ – [（S）-2-オキソアゼチジン-3-イル]カルバミン酸4- cyclohexylbutyl- N）16化合物ARN14686は全身活性、セリン由来βラクタムNAAA阻害剤の化学構造、ARN726に基づいて設計しました。 ARN726の4-t-ブチルシクロヘキシル基は、アジドベアリングレポータータグとその後のCCのコンジュゲートのための末端アルキンタグを担持するC9飽和脂肪族鎖で置換しました。私たちは、minimallに2段階のABPを設計することにしましたyはこのようにNAAAに対するプローブの親和性を維持し、元の足場の構造を変更します。また、かさばるタグの導入を避け、そのようなプローブは、直接ABPよりin vivoでの治療のためのより適切である可能性があります。 ARN14686は、酵素12の触媒システインと共有結合付加物を形成することにより、高い効力を有するNAAA（hNAAA IC 50 = 6 nMで、rNAAA IC 50 = 13 nM）を阻害します。生きたラットの実験では、プローブは、NAAAは肺で発現撮影において選択的であることが示されました。高いプローブ濃度（ インビトロでの 10μM、10ミリグラム/静脈、静脈ミリリットル）12を使用する際に酸セラミダーゼ、NAAAと33-34％の同一性を共有する他のシステインアミダーゼは、低親和性標的として同定されました。我々はまた、完全フロイントアジュバント（CFA）29の投与後の炎症を起こしたラット組織における活性NAAAの存在を研究するためにARN14686を使用しています。
ここでは、preparatiためのプロトコルの概要を説明します（ 図1）及びex vivoで NAAA活性化の調査への応用ARN14686の上。例として、我々は、CFA投与後のラットの足でNAAAを可視化する実験手順を説明します。この実験では、タンパク質は、プローブの静脈注射後の足の組織から抽出され、ABP標識プロテオームは、ビオチンアジドとCCに供されます。ビオチン化されたサンプルは、ストレプトアビジンビーズを使用して濃縮され、そしてタンパク質ブロットが行われます。別のアプリケーションでは、我々は、プローブ処置マウスからのマウスの肺における蛍光顕微鏡により活性NAAAの局在化を説明します。この場合には、組織を切片化し、切片をローダミン添加用CCに供されます。ワークフロー方式は、図2に示されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
酵素活性は、微RNA転写、タンパク質合成、タンパク質の転座、翻訳後修飾、およびタンパク質 – タンパク質相互作用を含む種々のレベルで調節されます。多くの場合、単独の酵素の発現は、その活性を考慮していません。 ABPPは、その天然の状態でタンパク質の活性を研究するために開発されました。二つの機能が必要とされている：共有結合プローブで標識された酵素を検出するために、?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Nikon Imaging Center at Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italy (NIC@IIT).
Materials
| 1,1’-sulfonyldiimidazole | Sigma Aldrich | 367818 | Harmful |
| 2-dipyridylcarbonate | Fluorochem | 11331 | Harmful |
| 2-Methylbutan | Sigma Aldrich | M32631 | Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment |
| 4-(Dimethylamino)pyridine | Sigma Aldrich | 107700 | Toxic |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | Flammable, Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | Flammable, Toxic |
| Activated charcoal | Sigma Aldrich | 161551 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | Harmful |
| Azide-PEG3-Biotin | Jena Biosciences | CLK-AZ104P4 | |
| Azide-PEG3-Fluor 545 | Jena Biosciences | CLK-AZ109 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Blocking buffer | Li-Cor Biosciences | 927-40000 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | Higly toxic |
| Bovin serum albumine (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | B0126 | |
| Bruker Avance III 400 | Bruker | ||
| Celite | Sigma Aldrich | 419931 | Health hazard |
| Ceric ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 22249 | Oxidizing, Harmful |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich | C8383 | Higly toxic |
| CuSO4.5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Toxic |
| Cyclohexadiene | Sigma Aldrich | 125415 | Flammable, Health hazard |
| Cyclohexane | Sigma Aldrich | 34855 | Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 34856 | Harmful, Health hazard |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | Flammable, Harmful |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Acros Organics | 348441000 | |
| Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) | Sigma Aldrich | 175943 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | Flammable, Harmful |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 34858 | Flammable, Harmful |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Irdye 680-LT Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-68031 | |
| IRDye680-LT Streptavidin | Licor | 925-68031 | Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34966 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Flammable, Toxic, Health hazard |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E7750 | Harmful, Corrosive |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | Flammable, Corrosive, Toxic |
| N,N-dimethylformamide | Sigma Aldrich | 227056 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| N-Cbz-L-Serine | Fluorochem | M03053 | Harmful |
| Nikon A1 confocal microscopy | Nikon | Read the user manual | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | |
| Palladium on carbon | Sigma Aldrich | 330108 | |
| p-anisidine | Sigma Aldrich | A88255 | Toxic, Health hazard, Environmental hazard |
| Paraformaldehyde | sigma Aldrich | 441244 | Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | P3265 | |
| ProLong Gold antifade mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | Avoid bubbles formation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Toxic, corrosive, falmmable |
| Sodium hydride | Sigma Aldrich | 452912 | Flammable |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | |
| Starion FLA-9000 immage scanner | FUJIFILM | Read the user manual | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20349 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Tert-butanol | Sigma Aldrich | 360538 | Toxic, flammable |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 186562 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| Thiourea | Acros Organics | 424542500 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
| Tris | Sigma Aldrich | RDD008 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| Triton-x100 | Sigma Aldrich | X100 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer | IKA | ||
| Undec-10-yn-1-ol | Fluorochem | 13739 | Harmful |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
Riferimenti
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