Индуцируемая T7-РНК-полимераза-опосредованная мультигенная экспрессия, pMGX
Summary
В этом исследовании описаны способы опосредованной T7 совместной экспрессии нескольких генов из одной плазмиды в Escherichia coli с использованием плазмидной системы pMGX.
Abstract
Совместная экспрессия нескольких белков приобретает все большее значение для синтетической биологии, изучает белково-белковые комплексы и характеризует и использует пути биосинтеза. В этой рукописи описывается использование высокоэффективной системы для построения мультигенных синтетических оперонов под контролем индуцируемой РНК-полимеразы Т7. Эта система позволяет одновременно размножать гены из одной плазмиды. Здесь набор из четырех связанных векторов, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K и pMGX-hisK, с маркером (A и K), устойчивым к ампициллину или канамицину, и либо обладающим, либо отсутствующим N-концевым гексагистидином Тег (его). Подробные протоколы для построения синтетических оперонов с использованием этой векторной системы предоставляются вместе с соответствующими данными, показывая, что система на основе pMGX, содержащая пять генов, может быть легко сконструирована и использована для получения всех пяти кодированных белков в Escherichia coli . Эта системаEm и протокол позволяют исследователям регулярно выражать сложные многокомпонентные модули и пути в E. coli .
Introduction
Совместная экспрессия нескольких белков становится все более существенной, особенно в приложениях для синтетической биологии, где должны быть выражены несколько функциональных модулей 1 ; При изучении белково-белковых комплексов, где экспрессия и функция часто требуют совместного экспрессии 2 , 3 ; И в характеристике и использовании путей биосинтеза, где каждый ген в пути должен быть выражен 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Был разработан ряд систем для совместной экспрессии, особенно в организме хозяина Escherichia coli , рабочей лошади для экспрессии лабораторного рекомбинантного белка 9 . Например, несколько плазмид с различными выбираемыми маркерами могут быть использованы для экспрессии отдельных белков с использованием богатства различных экс Векторы растяжения 10 , 11 . Одиночные плазмидные системы для множественной экспрессии белка использовали либо множественные промоторы для контроля экспрессии каждого гена 10 , 12 ; Синтетические опероны, где множественные гены кодируются на одном транскрипте 2 , 13 ; Или, в некоторых случаях, один ген, кодирующий полипептид, который в конечном счете протеолитически обработан, давая желаемые представляющие интерес белки 14 .
Рисунок 1: рабочий процесс pMGX, показывающий построение полицистронного вектора. Система pMGX обеспечивает гибкую и легкую в использовании стратегию для создания синтетических оперонов под контролем индуцибельного промотора T7.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В этой рукописи описывается использование высокоэффективной системы для построения мультигенных синтетических оперонов под контролем индуцируемой РНК-полимеразы Т7 ( фиг. 1 ). Эта система позволяет одновременно размножать гены из одной плазмиды. Он основан на плазмидной системе, первоначально называемой pKH22, которая была успешно использована для ряда различных приложений 6 , 7 , 8 . Здесь этот набор плазмид расширяется до четырех связанных векторов: pMGX-A, экспрессирующего вектора, лишенного любых C- или N-концевых тегов, и маркера устойчивости к ампициллину; PMGX-hisA, вектор экспрессии, кодирующий N-концевую гексагистидиновую метку и маркер устойчивости к ампициллину; PMGX-K, вектор экспрессии lПодбирая любые C- или N-концевые метки и маркер устойчивости к канамицину; И pMGX-hisK, вектор экспрессии, кодирующий N-концевую гексагистидиновую метку и маркер устойчивости к канамицину. В этом исследовании продемонстрирован способ генерации полицистронного вектора, содержащего пять генов с использованием системы pMGX, в частности pMGX-A, наряду с успешным продуцированием каждого отдельного белка в Escherichia coli .
Protocol
Representative Results
Discussion
Совместная экспрессия множественных генов приобретает все большее значение, особенно при характеристике и восстановлении сложных многогенных метаболических путей 3 , 4 , 5 . Система pMGX делает мультигенную совместную экспрессию в рутин…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады.
Materials
| Enzymes | |||
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England Biolabs | M0290S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N3232L | |
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50 x TAE | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| Ampicilin | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) chemically comeptent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies | Supplied with polymerase | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972 |
| Glycine | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
| His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse | GenScript | A00612 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| Methanol | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| Pasteurized instant skim milk powder | Local grocery store | No-name grocery store milk is adequate | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | Membrane PT 0.45 µm 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086 |
| Plasmid DNA Isolation Kit | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898 |
| pMGX | Boddy Lab | Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca | |
| Primers | Intergrated DNA Technologies | Design primers as needed for desired gene | |
| Synthetic Gene | Life Technologies | Design and optimize as needed | |
| Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Tris base | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue chemically competent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| Gel box – PAGE | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell |
| Gel Imager | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| Incubator-oven | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | Isotemp |
| Incubator-shaker | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
| Personna Razors | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
| Power Pack | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
| Transilluminator | VWR International | M-10E,6W | |
| Thermocylcer | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal, supplied by Sigma |
| UV Face-Shield | 18-999-4542 | ||
| Waterbath | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| Western Transfer Apparatus | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Cell |
Riferimenti
- Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
- Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
- Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
- Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
- Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
- Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
- Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
- Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
- Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Kim, K. -. J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
- Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
- Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
- Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016)
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016)
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).
