Summary
עבודה זו מתארת שיטות להקמת מודלים של היפרגליקמיה חריפה וכרונית בדג הזברה. המטרה היא לחקור את ההשפעה של היפרגליקמיה על תהליכים פיזיולוגיים, כגון נוירוגנזה מכוננת ופציעה המושרה. העבודה גם מדגיש את השימוש דג הזברה כדי לעקוב אחר מולקולות radiolabeled (כאן, [ 18 F] -FDG) באמצעות PET / CT.
Abstract
Hyperglycemia היא בעיה בריאותית מובילה שמוביל לב וכלי דם וליקוי מוחי. למשל, היא קשורה בבעיות נוירולוגיות מוגברות לאחר שבץ ומוצגת על מנת לפגוע בתהליכים נוירוגניים. מעניין, דג הזברה המבוגר התפתחה לאחרונה כמודל רלוונטי ושימושי לחקות היפרגליקמיה / סוכרת ולחקור נוירוגנזה מכוננת מחדש. עבודה זו מספקת שיטות לפתח מודלים דג הזברה של hyperglycemia לחקור את ההשפעה של hyperglycemia על התפשטות תאים במוח תחת homeostatic ותיקון המוח תנאים. היפרגליקמיה חריפה נוצרת באמצעות הזרקת intraperitoneal של גלוקוז D (2.5 גרם / ק"ג bodyweight) לתוך דג הזברה מבוגר. היפרגליקמיה כרונית נגרמת על ידי הטמנת דג הזברה מבוגר ב- D גלוקוז (111 מ"מ) המכיל מים במשך 14 ימים. מדידות ברמת גלוקוז בדם מתוארות עבור גישות שונות אלה. שיטות לחקור את ההשפעה של היפרגליקמיה על מכונן אNd negengenesis משובי, על ידי תיאור של פגיעה מכנית של telencephalon, לנתח את המוח, הטבעה פרפין וחתך עם microtome, וביצוע הליכים אימונוהיסטוכימיה, הם הוכיחו. לבסוף, השיטה של שימוש דג הזברה כמודל רלוונטי ללימוד biodistribution של מולקולות radiolabeled (כאן, [ 18 F] -FDG) באמצעות PET / CT מתואר גם.
Introduction
היפרגליקמיה מוגדרת ברמות גבוהות של גלוקוז בדם. למרות שזה יכול לשקף מצב של לחץ חריף, היפרגליקמיה היא גם מצב שלעתים קרובות מוביל לאבחון של סוכרת, הפרעה כרונית של הפרשת אינסולין ו / או התנגדות. בשנת 2016, מספר המבוגרים החיים עם סוכרת הגיע 422,000,000 ברחבי העולם, ובכל שנה, 1.5 מיליון בני אדם מתים ממחלה זו, מה שהופך אותו בעיה בריאותית גדולה 1 . ואכן, סוכרת בלתי מבוקרת מובילה למספר הפרעות פיזיולוגיות המשפיעות על מערכת הלב וכלי הדם, הכליות ומערכות העצבים ההיקפיים והמרכזיים.
מעניין, היפרגליקמיה חריפה כרונית עשויה לשנות את הקוגניציה ולתרום הן דמנציה ודיכאון 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . בנוסף, הודאה של חולים wהיפרגליקמיה ith קשורה לתפקוד תפקודי, נוירולוגי והישרדות גרוע יותר לאחר שבץ איסכמי 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . כמו כן, הוכח כי היפרגליקמיה / סוכרת משפיעה על נוירוגנזה מבוגר, תהליך המוביל לדור של נוירונים חדשים, על ידי השפעה על פעילות תאי גזע עצביים ועל בידול נוירונים, הגירה והישרדות 2 , 12 .
בניגוד יונקים, דגים teleost, כמו דג הזברה, להציג פעילות נוירוגנית אינטנסיבי לאורך המוח כולו ולהציג יכולת יוצאת דופן לתיקון המוח במהלך בגרות 13 , 14 , 15 , 16 . יש לציין, יכולות כאלה אפשריות בשל ההתמדה של neuRal גזע / בתאים, כולל גליה רדיאלי ו neuroblasts 17 , 18 , 19 . בנוסף, דג הזברה התגלה לאחרונה כמודל לחקר הפרעות מטבוליות, כולל השמנה היפרגליקמיה / סוכרת 20 , 21 , 22 .
למרות דג הזברה הוא מודל מוכר היטב של hyperglycemia ו neurogenesis, כמה מחקרים חקרו את ההשפעה של היפרגליקמיה על הומאוסטזיס המוח תפקוד קוגניטיבי 12 , 23 . כדי לקבוע את ההשפעה של hyperglycemia על התפשטות תאים במוח מכונן פציעה המושרה, מודל של היפרגליקמיה חריפה נוצר באמצעות הזרקת intraperitoneal של גלוקוז D. בנוסף, מודל של hyperglycemia כרונית היה לשכפל באמצעות טבילה של דגים במים בתוספת Wדלית גלוקוזה 12 . דג הזברה התערוכה יתרונות רבים במחקר. הם זולים, קל להעלות, שקוף במהלך השלבים הראשונים של הפיתוח, הגנום שלהם כבר רצף. במסגרת עבודה זו, הם מציגים מספר יתרונות נוספים: (1) הם חולקים תהליכים פיזיולוגיים דומים עם בני אדם, מה שהופך אותם לכלי קריטי למחקר ביו-רפואי; (2) הם מאפשרים חקירה מהירה של ההשפעה של היפרגליקמיה על הומאוסטזיס המוח neurogenesis, בהתחשב בפעילותם הנפוצה והחזקה neurogenic; ו (3) הם מודל חלופי, המאפשר הפחתת מספר היונקים המשמשים במחקר. לבסוף, דג הזברה יכול לשמש מודל לבדיקת biodistribution של מולקולות radiolabeled וסוכני טיפול פוטנציאליים באמצעות PET / CT.
המטרה הכוללת של ההליך הבא הוא ויזואלי לתעד כיצד להגדיר מודלים של היפרגליקמיה חריפה כרונית דג הזברה, להשתמש zebדגים כדי להעריך remodeling המוח בתנאים hyperglycemic, ולפקח על מולקולות radiolabeled (כאן, [ 18 F] -FDG) באמצעות PET / CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דג הזברה מבוגר למבוגרים ( Danio rerio ) נשמר תחת photoperiod תקן (14/10 שעות אור / כהה) וטמפרטורה (28 מעלות צלזיוס) תנאים. כל הניסויים נערכו על פי הנחיות הקהילה האירופית והאירופית לשימוש בבעלי חיים במחקר (86/609 / EEC ו 2010/63 / EU) ואושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית לניסוי בבעלי חיים.
1. הקמת מודל של היפרגליקמיה חריפה דג הזברה
- הכן פתרון המניות של tricaine (MS-222) על ידי המסת 400 מ"ג של אבקת tricaine ב 97.9 מ"ל מים ו 2.1 מ"ל של 1 M טריס / חיץ HCl (pH 9). התאם את ה- pH ל 7 ו aliquot לאחסון ב -20 מעלות צלזיוס.
- הכן הרדמה דג הזברה מבוגר על ידי הצבת 5 מ"ל של tricaine (פתרון המניה) לתוך 100 מ"ל של מים דגים (ריכוז tricaine הסופי: 0.02%).
- מעבירים דג הזברה אחד (3 עד 6 חודשים) מן הטנק שלו להרדמה עד שהוא מפסיק לזוז.
- מִחָדָשׁלהזיז את הדג באמצעות פיפטה לחתוך במהירות לייבש אותו על נייר רקמות סופג.
- שקלו את הדג.
- הכן מזרק של גלוקוז D מומס 1X PBS ולהזריק 50 μL של גלוקוז D (2.5 גרם / ק"ג bodyweight).
הערה: לדוגמה, דג 0.6 גרם יקבלו 50 μL של 3% D גלוקוז / פתרון PBS. - שים את הדג על הגב והכניס את המחט של המזרק לתוך חלל intraperitoneal.
- לאט לאט להזריק את D- גלוקוז / PBS פתרון ולאחר מכן למקם את הדג בחזרה למים.
- בדוק על הדג עד שהוא מתאושש לחלוטין. החזירו אותו למיכל עד שיגיע הזמן הנדרש לביצוע המדידה של גלוקוז הדם.
הערה: גלוקוז הדם נמדד 1.5 שעות לאחר ההזרקה.
2. הקמת מודל של היפרגליקמיה כרונית דג הזברה
- הכן טנק 2 L של מים דגים נקיים.
- ממיסים 40 גרם של גלוקוז D לתוך 2 L של מים דגים עבור ריכוז D גלוקוז הסופי של111 מ"מ.
- לטבול 5 עד 7 דג הזברה למבוגרים במים המכילים D- גלוקוז.
- החלף את D- גלוקוז מים דגים כל יומיים על מנת למנוע את הצמיחה של חיידקים או מיקרו אורגניזמים אחרים.
- לאחר 14 ימי טיפול, הניחו את הדג במים קצרים כדי להסיר את גלוקוז ה- D מחוץ לגוף לפני ביצוע המדידה ברמת הגלוקוז בדם.
3. מדידת רמות גלוקוז בדם דג הזברה
- מכסים את הדג עם קרח עבור המתת חסד מהיר.
הערה: אין להשתמש מנת יתר של tricaine, כמו זה גורם וריאציות רחב ברמות הסוכר בדם. אין להשאיר את הדג בקרח זמן רב מדי, כמו זה יגרום הדם קריש. - נגבו את הדגים עם נייר רקמה סופג כדי להסיר את כל המים כדי למנוע דילול דם במהלך מדידת הגלוקוז בדם.
- הסר את העין באמצעות מלקחיים לנתח ולהמתין עד חלל העין מלא בדם.
- שים רצועת בדיקה על glucometer ואניNsert את הרצועה לתוך חלל העין.
- למדוד את רמות הגלוקוז בדם.
4. ניתוח פרוליפרציה תא המוח בעקבות היפרגליקמיה
- פתרונות ומאגרים: דרישות והכנה
- הכן 1 L של 1x PBS ידי הוספת 100 מ"ל של 10x PBS 900 מ"ל של מזוקקים H 2 O (dH 2 O) ומערבבים.
- הכן 1x PBS עם דטרגנט 0.2% (PBS-T, לראות את טבלת החומרים).
הערה: כדי להכין 1 L של PBS-T, להוסיף 2 מ"ל של חומר ניקוי (ראו את טבלת חומרים ) ל 1 L של PBS. - הכן אתנול סדרה (100% x 2, 95%, 85%, 70%, 50%, ו -30%) ו 0.85% NaCl.
- הכן חיץ חסימה: PBS-T המכיל 0.5% אבקת חלב 1%.
הערה: כדי להכין 200 מ"ל של חיץ חסימת, להוסיף 2 גרם של אבקת חלב ל 200 מ"ל של PBST. - הכן חיץ אחזור אנטיגן, ציטרט נתרן.
הערה: כדי להכין 1 L למאגר ציטראט נתרן, להוסיף 2.94 גרם של נתרן ציטראט שלושנתרן מלח להתייבש ל 1 L של dH 2 0. להתאים את ה- pH ל -6 לפני מילוי ל 1 ל. - הכן 4% paraformaldehyde-PBS חיץ, הוספת 4 גרם של paraformaldehyde ל 100 מ"ל של 1x PBS. חם זה תחת תסיסה ב 58-60 מעלות צלזיוס עד שהוא מתמוסס לחלוטין.
- לדוגמא הכנה עבור אימונוהיסטוכימיה: קיבוע והתייבשות
- לאחר מדידת רמת הגלוקוז בדם, הפרד את הראש מהגוף על ידי חיתוך הראש מאחורי הזימים.
הערה: לחלופין, המוח יכול להיות מופק ישירות וקפא עבור ניסויים אחרים, כגון מיצוי mRNA. - תקן את הלילה לילה ב 4 מעלות צלזיוס paraformaldehyde 4% מומס PBS (PFA-PBS).
- למחרת, לשטוף בקצרה את ראשי PBS.
- לנתח את המוח בזהירות באמצעות מיקרוסקופ. שוטפים את הראש קבוע עם PBS ולהשתמש מחט כדי לאבטח את הראש תחת מיקרוסקופ לנתח. הסר את העיניים ואת החלק העליון של הגולגולת עם מלקחיים. CarefuLly לחלץ את המוח ולמקם אותו 1x PBS.
- לשטוף את המוח קבוע עם 1x PBS במשך 30 דקות, 0.85% NaCl למשך 30 דקות, 70% EtOH / 0.85% NaCl (v / v) במשך 15 דקות, EtOH 70% עבור 15 דקות (פעמיים), EtOH 85% עבור 20 דקות, EtOH 95% במשך 20 דקות, ו 100% EtOH במשך 20 דקות (פעמיים). דגירה לילה פתרון סופי 100% EtOH.
הערה: המוח מיובש יכול להישאר במשך מספר חודשים EtOH 100% ב 4 ° C לפני הטבעת פרפין.
- לאחר מדידת רמת הגלוקוז בדם, הפרד את הראש מהגוף על ידי חיתוך הראש מאחורי הזימים.
- הכנה לדוגמא עבור אימונוהיסטוכימיה: הכנת רקמות עבור הטבעה פרפין
- מניחים את המוח בכוס זכוכית קטנה.
הערה: אין להשתמש בכלי קיבול מפלסטיק, שכן טולואן עלול לגרום נזק לחלק מהפלסטיק. - הסר את אתנול ולהחליף אותו עם טולואן, כמו המוח חייב להיות התאושש לחלוטין על ידי טולואן. בצע שתי דקות 30 אמבטיות של טולואן.
- הסר את טולואן ומניחים את המוח בקלטת הטבעה. שים את הקלטת הסגורה של כוסות פרפין מותך בסדרה 58-60 ° C (30 דקות בכל כוס פרפין). הפעל את מלקחיים הכללה ההתחממות. בסוף אמבטיות הפרפין, מוציאים את הקלטת ויוצקים קצת פרפין נוזלי לתוך תבנית.
- יוצקים את פרפין מותך לתוך עובש ומכניסים את המוח פנימה. אוריינט את המוח באמצעות מלקחיים הכללה ההתחממות, באמצעות אוריינטציה anteroposterior של המוח כמדריך. תן את הפרפין להקשות על החלק הקירור של מכונת הטבעת.
- מסיבות טכניות, למקם את המוח לאורך הציר anteroposterior. לאחר unmolding בלוק פרפין, לחתוך אותו ולתקן אותו על קלטת, עם פרפין מותך בכיוון הנכון כדי לאפשר חתך רוחבי.
- הכנס את גוש פרפין לתוך הזרוע של microtome. חותכים 50 חלקים מיקרומטר עבה עד רמת מדגם המוח הוא הגיע. חתוך את גוש פרפין כדי להשיג טרפז ולהתאים את עובי החתך עד 7 מיקרומטר. לאסוף את סרטי פרפין באמצעות מכחול ומניחים אותם על pap שחורEr. חותכים אותם בעדינות כל 3 עד 4 חלקים.
- שים שקופית על צלחת ההתחממות לכסות אותו עם מים DH 2 O.
- בעדינות את הסרט לחתוך סרטים על המים. הסר את המים עם נייר רקמה סופג כאשר סרטים פרפין מתפשטים מספיק / נפרש. הסר את הטיפות האחרונות מכנית. הסר את המים מן השקופיות ולתת להם להתייבש לפחות 3 שעות על צלחת ההתחממות בסביבות 30-40 מעלות צלזיוס.
- מניחים את המוח בכוס זכוכית קטנה.
- נוהל אימונוהיסטוכימיה
- הסר את השעווה פרפין ידי הצבת חלקים בשלושה מיכלים של קסילן במשך 7 דקות כל אחד.
- Rehydrate את החלקים על ידי לשים את השקופיות בשתי מכולות של EtOH 100% עבור 2 דקות כל אחד, ואחריו אמבטיות של EtOH 95%, EtOH 85%, EtOH 70%, 30% EtOH עבור 30 s כל אחד. לבסוף, בקצרה את השקופיות ב DH 2 O ו פעמיים PBS במשך 5 דקות כל אחד.
- ביצוע אחזור אנטיגן על ידי דוגרים את הקטעים במאגר ציטראט במיקרוגל (2 דקות ב 500 W) עדהמאגר מתחיל לרתיחה. בואו השקופיות להתאושש בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- לשטוף שלוש פעמים PBST, 5 דקות כל אחד, לחסום את הקטעים במשך 45 דקות PBST המכיל חלב 1%. דגירה לילה עם נוגדנים ראשוניים ( למשל תאים מתרבים גרעיני תאים (PCNA) עבור מכתים תאים שגשוג, 1/100) מדולל לחסום חיץ ( כלומר PBST, חלב 1%).
- לשטוף שלוש פעמים ב PBST, 5 דקות כל אחד, דגירה הקטעים במשך 90 דקות עם נוגדנים משני מתאים ( למשל נגד עכבר Alexa פלואור 488, 1/200) מדולל חסימת חיץ עם DAPI (1/500).
- לשטוף שלוש פעמים PBST, 5 דקות כל אחד, ואת הר שקופיות עם המדיום הרכבה ניאון (ראה את טבלת החומרים).
- לנתח את מכתים באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence ו / או confocal.
- לכמת את התפשטות תאים במוח על לפחות שלושה חלקים רצופים במוח של אזור עניין לפחות שלושה מובחניםאימלס.
הערה: לחלופין, הטבעה המוח יכול להיעשות agarose להמשיך חתך vibratome ו-צף חינם אימונוהיסטוכימיה, כפי שתואר לעיל 24 .
- לימוד השפעת היפרגליקמיה על מנגנוני תיקון המוח
הערה: לחלופין, החקירה של תיקון המוח תחת היפרגליקמיה חריפה כרונית יכולה להתבצע לאחר פגיעה פציעה דקירה של telencephalon, כפי שתואר לעיל 24 , 25 , 26 . בקצרה:- להרדים דג הזברה מבוגר עם tricaine.
- מניחים את הדגים תחת מיקרוסקופ לנתח עם אור.
- להחזיק את הדג ביד אחת.
- מצד שני, הכנס מזרק 30 G אנכית דרך הגולגולת לתוך האזור המדיאלי של חצי הכדור הימני telesphalere.
- מניחים את הדג בחזרה למים דגים טריים, מים בתוספת גלוקוז (111)MM), או לשלוט במים דגים. אפשר לדגים לשרוד במשך 7 ימים לאחר הפציעה.
הערה: עיין בשלב 4 עבור שאר ההליך.
5. הדמיה ביודיסטריבוציות של מולקולות Radiolabeled ידי PET / CT דג הזברה: Fluorodeoxyglucose ([18F] -FDG) כדי לנתח את חילוף החומרים גלוקוז
- הכן מזרק 50 μL המכיל 20 MBq של תמיסת מלח של [18F] -FDG.
- מניחים את המזרק מאחורי המסך מגן קרינה.
- להרדים דג הזברה מבוגר עם tricaine.
- מניחים את הדגים מאחורי מסך הקרנה.
- להזריק [18F] -FDG לתוך חלל intraperitoneal. נגבו את אתר ההזרקה עם פיסת נייר קטנה כדי למנוע זיהוי של שרידי [18F] -FDG שיכולים לדלוף מתוך בטן הדגים.
- השתמש calisrator radioisotope למדוד את הפעילות הנותרים הכלולים על המזרק ואת הרקמה כדי לחשב את המינון המוזרק המדויק.
- מניחים את הדג עלEW, חתיכה קטנה של רקמות סופג ספוג עם tricaine בעדינות לעטוף אותו. מניחים את הדג עם רקמות סופג על המיטה של PET / CT imager.
- הכנס את המיטה לתוך הדמיה PET / CT מערכת ולהתחיל את הרכישה.
- המשך לבצע את הרכישה PET / CT.
- בסוף ההליך, מניחים את הדג בחזרה לתוך כמות קטנה של מים דגים טריים.
הערה: לחלופין, לאחר הזרקת [18F] -FDG, הדג יכול להיות מוחזר לכמות קטנה של מים מתוקים למשך 10 דקות עד 1 שעות כדי להקל על דיפוזיה של [18F] -FDG לפני הרדמה של הדג שוב עבור PET / CT הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליכים המתוארים במאמר זה, הזרקת intraperitoneal של גלוקוז D (2.5 גרם / ק"ג bodyweight) בוצעה על דג הזברה המבוגר והוביל לעלייה משמעותית ברמות הסוכר בדם 1.5 שעות לאחר ההזרקה ( איור 1 א ). 24 שעות לאחר הזריקה, רמות הגלוקוז בדם היו דומות בין D-glucose ו- PBS מוזרק דגים 12 . עבור טיפול כרוני, דג הזברה היו שקועים במים גלוקוז D (111 מ"מ) והופך היפרגליקמיה בסוף 14 ימים של טיפול ( איור 1B ), כפי שמוצג בעבר 12 , 22 .
כדי לחקור את ההשפעה של hyperglycemia על התפשטות תאי המוח, PCNA אימונוהיסטוכימיה בוצעה על מוח דג הזברה בעקבות אינדוקציה של היפרגליקמיה חריפה כרונית. למרות hypergl חריפה Yicmia לא השפיעה על התפשטות תאי המוח 12 , היפרגליקמיה כרונית גרמה לירידה משמעותית בתפוצת תאי גזע עצביים לאורך החדר, כפי שהראה בעבר Dorsemans ועמיתיו (2016). ואכן, מספר תאים חיוביים PCNA הופחת subpallium (Vv / Vd), פליום (Dm), ואת האזורים המקיפים את ההפסקה לרוחב האחורי של היפותלמוס הזנב (LR / PR) ( איור 2 ).
פגיעה נוירוגנזה שנגרמה על-ידי נחקר גם לאחר פגיעה מכנית של הטלנספלון תחת היפרגליקמיה חריפה וכרונית. כפי שתואר לעיל לאחר פגיעה מוחית דג הזברה, התפשטות פרנכימאלית הראשונה של תאים מיקרוגליאל ו oligodendrocytes התרחשה, ואחריו חזק למעלה רגולציה של התפשטות בשכבה חדר 7 ימים לאחר הפציעה 25 , 27 , , 28 , 29 , 30. היפרגליקמיה חריפה לא לווסת את הצעד הראשוני של התפשטות פרנכימה במוח, לעומת זאת, היפרגליקמיה כרונית פגום התא התאי המוח לאורך החדרים telensphalic 7 ימים לאחר הפציעה ( איור 3 ).
מודל דג הזברה הוא גם מעניין לניטור biodistribution של מולקולות radiolabeled באמצעות PET / CT הדמיה. הנה, [18F] -FDG היה מוזרק intraperitoneally לתוך דג הזברה המבוגר. לאחר 30 דקות, רכישת PET / CT מראה כי גלוקוז מופץ לא רק באתר ההזרקה, אלא גם בראש הדג, כולל המוח, לאורך חוט השדרה ( איור 4 ).
איור 1 : מודלים חריפים וכרוניים של היפרגליקמיה בדגי הזברה ( A ) הזרקת intraperitoneal של גלוקוז D (2.5 גרם / ק"ג bodyweight) גורמת לעלייה משמעותית ברמות הסוכר בדם 1.5 שעות לאחר ההזרקה (n = 3) ) ( ב ) הטבילה של דג הזברה במים D גלוקוז (111 מ"מ) במשך 14 ימים התוצאות עלייה משמעותית ברמות הסוכר בדם (n = 15) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 : היפרגליקמיה כרונית פוגעת בהתפשטות תאי המוח לאחר 14 יום של טיפול. תאים Propliferative מסומנים בירוק עם נוגדן PCNA. גרעיני תאים הם counterstained עם DAPI (כחול). כרוני חYperglycemia מקטין את התפשטות תאי המוח לאחר 14 ימים של טיפול subpallium ( A ), בפליום ( B ), וכן ההיפותלמוס הזנב סביב ההפסקה לרוחב האחורי של החדר ( C ). סולם בר = 120 מיקרומטר (A ו- B), 200 מיקרומטר (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 : פגיעה פציעה דקירה של telencephalon upregulates התפשטות המוח ב -7 ימים שלאחר הנגע. ( א ) סקירה סכמטית של קטע חוצה של telesphalon דג הזברה ברמה המצוינת sagittal העליון. סכימה נלקחו אטלס המוח דג הזברה 31 . שם נקודות d מצביעים על תאים מתרבים 32 , 33 . המחט מציינת את האתר של הנגע. ( ב ) PCNA (ירוק) אימונוהיסטוכימיה 7 ימים לאחר פגיעה מוחית מראה upregulation חזק של התפשטות לאורך החדר במוח טלנספלון פצוע. סולם בר = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 : הדמיה PET / CT של [18F] -FDG (20 MBQ מוזרק) 30 דקות לאחר הזריקה intraperitoneal. תמונות נציג של הדמיה PET / CT להראות הפצה רחבה של [18F] -FDG בגוף דג הזברה, כולל הראש, המוח, חוט השדרה."/ Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבודה זו מתארת שיטות שונות כדי להקים מודלים חריפים כרוניים של היפרגליקמיה דג הזברה. היתרונות העיקריים של נהלים אלה הם: (1) הם מאפשרים הפחתת מספר היונקים המשמשים למחקר, (2) הם פשוט להקים ומהיר ליישם, (3) הם חסכוני. לכן, מודלים אלה מאפשרים לחקירת ההשפעה של היפרגליקמיה על מספר רב של בעלי חיים כדי לחקור את השפעתה על תהליכים פיזיולוגיים שונים, כולל אפקט של טרשת עורקים, הפרעות בתפקוד הלב וכלי הדם, רטינופתים, דליפת דליפת מוח בדם, ונוירוגנזה מכוננת ושיקומית. עבודה זו מתארת כיצד להמשיך עם חקירות על ההשפעות של hyperglycemia על התפשטות תאים במוח בתנאים נורמליים או פציעה המושרה.
מגבלה קריטית אחת של הליך היפרגליקמיה כרונית היא, שבניסויים מסוימים, כמה דגים אינם מציגים היפרגליקמיה לאחר הטבילה הכרוניתב D- גלוקוז מים (111 מ"מ במשך 14 ימים). אחוז הדגים היענים ולא מגיבים הוערך בעבר על ידי Dorsemans ועמיתיו (2016) להיות 83% לעומת 17%, בהתאמה. זה אפשרי כי דגים להציג רגישות הפרט על פי גילם, המין, ואת היכולת לפצות על היפרגליקמיה על ידי הפיכת יותר תאים β 34 הלבלב , 35 . עבור היפרגליקמיה חריפה, רמות הגלוקוז בדם די הומוגניות 1.5 שעות לאחר ההזרקה, מדגימות את החוסן של השיטה.
שלב קריטי בהליך זה נוגע למדידות ברמת גלוקוז בדם. כמות הדם הממלא את חלל העין היא, במקרים נדירים, נמוכה מדי כדי לאפשר את הטעינה של רצועת הבדיקה glucometer. בנוסף, הדג לא צריך להישאר על הקרח זמן רב מדי על מנת למנוע קרישת דם. עם זאת, הם צריכים להישאר על הקרח במשך זמן מספיק כדי להבטיח את אינדוקציה של הרדמהIa ואת המוות של החיות. חשוב גם לציין כי, עבור hyperglycemia חריפה, נפח של גלוקוז D מוזרק צריך להיות שונה כדי להסביר את גודל הדגים. 50 μL הזרקת intraperitoneal מיועד דג בגודל בינוני (0.5 גרם). ואכן, דג קטן לא יוכלו לקבל הזרקה intraperitoneal 50 μL ואת נפח הזרקת חייב להיות מופחת כדי למנוע סבל של בעלי חיים כדי למנוע פתרון דחף ישר החוצה על ידי הלחץ.
צעד קריטי נוסף הוא שחזור של פגיעה פציעה דקירה של telencephalon מבוגר; אשר דורש קצת ניסיון טכני. בנוסף, הספירה צריכה להתבצע על שלושה חלקים רצופים של אזור של עניין ושלושה בעלי חיים לפחות. ספירה אוטומטית באזורים מוחיים גדולים יותר יכולה לחשוף מידע חשוב על ההשפעה הגלובלית של היפרגליקמיה על תהליך neurogenesis.
סיבה נוספת להשתמש זברהףIsh הוא היכולת לפקח על biodistribution של מולקולות radiolabeled באמצעות PET / CT. הנה, [18F] -FDG שימש, והפצה שלו לאורך הגוף דג הזברה הוכיח, בעיקר כולל את המוח ואת חוט השדרה. טכניקות אלה הן בעלות עניין מיוחד בעת קביעת המשלוח ואת bioacumulation של סוכני טיפול פוטנציאליים ב מודלים vivo . טכניקה זו מייצגת גם שיטה חלופית לחקור את היכולת של כמה מולקולות לעבור את מחסום הדם במוח כדי לקבוע את ההשפעות הפוטנציאליות על מערכת העצבים המרכזית בתנאים פיזיולוגיים או פתופיזיולוגיים. ואכן, hyperglycemia ו hypoglycemia ידועים לווסת חדירות דם מוח מחסום 36 .
אחת ההגבלות הקריטיות של הדמיה PET / CT דג הזברה לאחר הזרקה intraperitoneal הוא הצורך להרדים את הדג על מנת למנוע כל תנועה במהלך הרכישה. הרדמה כזויכול להפחית באופן משמעותי את קצב הלב ולכן biodistribution radiotracer. כדי לפתור בעיה זו, דגים יכולים להיות מוזרקים מותר להתאושש במים מתוקים במשך כמה דקות או שעות, בהתאם פרוטוקול הדמיה ואת מחצית החיים של radioisotope בשימוש. בנוסף, הזרקת intraperitoneal עלולה לגרום הצטברות חזקה של האות בחלל הצפק.
לסיכום, עבודה זו תיארה שיטות יעילות כדי ליצור מודלים של היפרגליקמיה דג הזברה כדי לפקח על הפצה מולקולה radiolabeled. גישות אלו יכולות לפתוח שדה מחקר הנוגע לחקר השפעת הפרעות מטבוליות על ההומיאוסטזיס המוחי ועל הפצה ביולוגית של גורמים טיפוליים פוטנציאליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא נחשפו ניגודי אינטרסים אפשריים.
Acknowledgments
אנו מודים מאוד לכוון דז'ונס דו נומריק (DUN) מאוניברסיטת לה ראוניון לעריכת הסרטון (במיוחד ז'אן פרנסואה פברייה, אריק אסנוט וסילבאן דוקאסה), לינדה-רוזה מוטגאן על הקריינות, מרי אוסבורן-פלגרין להגהה את הקול מעל, ואת פלטפורמת CYROI. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מאוניברסיטת La Réunion (בונוס Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), המועצה האזורית של לה ראוניון, האיחוד האירופי (CPER / FEDER), ועמותת פילאנסיה. ACD היא מקבלת מענק המלגה מ Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche, La Réunion University (Contrat Doctoral).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
| Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
| Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
| Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
| Fish Strain | AB | ||
| Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
| Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
| Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
| Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
References
- W. Diabetes. , Available from: http://www.who.int/diabetes/en (2016).
- Ho, N., Sommers, M. S., Lucki, I. Effects of diabetes on hippocampal neurogenesis: links to cognition and depression. Neurosci Biobehav Rev. 37 (8), 1346-1362 (2013).
- Cukierman, T., Gerstein, H. C., Williamson, J. D. Cognitive decline and dementia in diabetes--systematic overview of prospective observational studies. Diabetologia. 48 (12), 2460-2469 (2005).
- Gaudieri, P. A., Chen, R., Greer, T. F., Holmes, C. S. Cognitive function in children with type 1 diabetes: a meta-analysis. Diabetes Care. 31 (9), 1892-1897 (2008).
- Brismar, T., et al. Predictors of cognitive impairment in type 1 diabetes. Psychoneuroendocrinology. 32 (8-10), 1041-1051 (2007).
- Ojo, O., Brooke, J. Evaluating the Association between Diabetes, Cognitive Decline and Dementia. Int J Environ Res Public Health. 12 (7), 8281-8294 (2015).
- Capes, S. E., Hunt, D., Malmberg, K., Pathak, P., Gerstein, H. C. Stress hyperglycemia and prognosis of stroke in nondiabetic and diabetic patients: a systematic overview. Stroke. 32 (10), 2426-2432 (2001).
- Stead, L. G., et al. Hyperglycemia as an independent predictor of worse outcome in non-diabetic patients presenting with acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 10 (2), 181-186 (2009).
- Kagansky, N., Levy, S., Knobler, H. The role of hyperglycemia in acute stroke. Arch Neurol. 58 (8), 1209-1212 (2001).
- Gilmore, R. M., Stead, L. G. The role of hyperglycemia in acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 5 (2), 153-158 (2006).
- Desilles, J. P., et al. Diabetes mellitus, admission glucose, and outcomes after stroke thrombolysis: a registry and systematic review. Stroke. 44 (7), 1915-1923 (2013).
- Dorsemans, A. C., et al. Impaired constitutive and regenerative neurogenesis in adult hyperglycemic zebrafish. J Comp Neurol. , (2016).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Lindsey, B. W., Tropepe, V. A comparative framework for understanding the biological principles of adult neurogenesis. Prog Neurobiol. 80 (6), 281-307 (2006).
- März, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58 (7), 870-888 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L.
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520 (10), 2275-2316 (2012).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. Zebrafish. , 2611-2619 (2012).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 171, 58-65 (2014).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 274, 319-325 (2014).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. J Vis Exp. (90), e51753 (2014).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Rodriguez Viales, R., et al. The helix-loop-helix protein id1 controls stem cell proliferation during regenerative neurogenesis in the adult zebrafish telencephalon. Stem Cells. 33 (3), 892-903 (2015).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Wullimann, M., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain: A topological atlas. , Birhaüser Verlag. Basel, Switzerland. 1-144 (1996).
- Pellegrini, E., et al. Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish. J Comp Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488 (3), 290-319 (2005).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. iConcept Press. , 2611-2619 (2013).
- Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate Immersion in an External Glucose Solution Differentially Affects Blood Sugar Values in Older Versus Younger Zebrafish Adults. Zebrafish. , (2016).
- Prasad, S., Sajja, R. K., Naik, P., Cucullo, L. Diabetes Mellitus and Blood-Brain Barrier Dysfunction: An Overview. J Pharmacovigil. 2 (2), 125 (2014).
