عزل الميتوكوندريا سليمة من العضلات الهيكلية التي كتبها التفاضلية الطرد المركزي لقياسات عالية الدقة قياس التنفس
Summary
Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.
Abstract
Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.
Introduction
الطاقة الحيوية الميتوكوندريا وقدرات الجهاز التنفسي يمكن دراستها ليس فقط في الخلايا permeabilized أو ألياف ولكن أيضا في الميتوكوندريا المعزولة. في هذه الدراسة، وصفنا بروتوكول لعزل سليمة الميتوكوندريا العضلات والهيكل العظمي باستخدام الطرد المركزي التفاضلي لقياس قياس التنفس عالية الدقة.
لعزل الميتوكوندريا سليمة لقياس التنفس والأنسجة متجانسة وعزل الميتوكوندريا بطريقة تفاضلية الطرد المركزي التقليدي. وتستند هذه الطريقة التفاضلية الطرد المركزي على centrifugations متسلسل (في سلسلة من زيادة السرعة) من قدم للمرة الأولى من قبل Pallade الخليط الأنسجة وزملاء العمل منذ ما يقرب من 70 عاما 1. ومفروم النسيج أولا باستخدام مقص ويتجانس الخليط ميكانيكيا في الخالط الزجاج مع مدقة فضفاضة. بعد ذلك يتم طرد جناسة في السرعة المنخفضة والناتجة بيليه الذي يحتوي الأنسجة دون انقطاع، الخلويةيتم تجاهل الحطام ونوى. ثم، يتم طرد طاف عدة مرات بسرعة عالية ويتم جمع جزء المخصب الميتوكوندريا. مزايا الطريقة التفاضلية الطرد المركزي لعزل الميتوكوندريا هي: ط) طريقة سريعة والميتوكوندريا يمكن أن تكون معزولة داخل 1-1.5 ساعة (يجب أن يتم تنفيذ التجارب في الجهاز التنفسي في أسرع وقت ممكن)؛ ب) أنها غير مكلفة. والثالث) أنه فعال جدا والميتوكوندريا التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي التفاضلي والنقي بما فيه الكفاية لفحوصات قياس التنفس. عيوب طريقة الطرد المركزي المغاير لعزل الميتوكوندريا هي التي ط) الميتوكوندريا قد يحصل تلف وفكت خلال التجانس. ب) يمكن حلها تلوث الميتوكوندريا مع المكونات الخلوية الأخرى (بمزيد من غسل بيليه الميتوكوندريا مع الخطوات الطرد المركزي الإضافية)؛ ج) إمكانية اختيار القطعان الميتوكوندريا مختلفة، على سبيل المثال، خلال centrifugations التفاضلية الخطوات، معهد ماساتشوستس للتكنولوجياochondria مع انخفاض كثافة يمكن استبعاد 7؛ والرابع) يمكن قياس الخلوية المحيطة مفقود وإلا التنفس الأقصى النظري الميتوكوندريا. طريقة أخرى لعزل الميتوكوندريا لفحوصات قياس التنفس هو التدرج الكثافة الطرد المركزي 2. في هذه التقنية، والطبقات استخراج الأنسجة على حل السكروز أو التدرج Percoll (مع ارتفاع الكثافة في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي) وطرد في سرعة معينة، مما تسبب في الميتوكوندريا أن تكون معزولة من المكونات الخلوية الأخرى وفقا لمن الكثافة. وكثيرا ما يستخدم هذا الأسلوب لعزل الميتوكوندريا الدماغ مع تلوث منخفضة جدا من synaptosomes. ومع ذلك، الميتوكوندريا كبد الفئران معزولة بسبب كثافة التدرج الطرد المركزي الملوثة للغاية مع العضيات الخلوية الأخرى 3. واحد من أوجه القصور في هذه الطريقة هو أن التدرج السكروز موجودة في أنبوب الطرد المركزي قد تمزق ذلكلي الميتوكوندريا (صدمة التناضحي).
اعتمادا على نوع من الأنسجة. هناك بعض العوامل الهامة التي يجب مراعاتها لعزل الميتوكوندريا سليمة عن طريق الطرد المركزي التفاضلي. ضرورة الأولى هي التجانس الأنسجة بطريقة لطيفة. الأنسجة الرخوة مثل الكلى والدماغ والكبد تتطلب القوى الميكانيكية طيف تطبيقها خلال التجانس. وهذا يتناقض مع الأنسجة الصلبة مثل عضلة القلب والهيكل العظمي التي تتطلب القوى الميكانيكية أقوى من ذلك بكثير. عادة ما يتم التعامل مع الأنسجة المفروم مع بروتين قبل تجانس لتليين الأنسجة. وينبغي لجميع المخازن التي استخدمت خلال التجانس والطرد المركزي تكون الجليد البرد ويكون الرقم الهيدروجيني الفسيولوجية ذات الصلة مع القوة الأيونية وناضح متوافقة مع العصارة الخلوية 4، 5.
واحدة من مزايا الدراسة الطاقة الحيوية الميتوكوندريا المعزولة هو أن أغشية البلازما الخلوية لا تحتاج إلى أن تكون permeabilized مع المنظفات مثل ديجيتونين أو سابونين 4 و 6، والتي قد تؤثر سلبا على الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي. ميزة أخرى من الميتوكوندريا المعزولة هي غياب العوامل عصاري خلوي الأخرى، والتي قد تتداخل مع تحليل لوظائف الميتوكوندريا مثل استهلاك الأوكسجين. مساوئ استخدام الميتوكوندريا المعزولة هي اختيار المحتملة لبعض السكان الميتوكوندريا خلال الخطوات الطرد المركزي، والأضرار التي لحقت الميتوكوندريا خلال التجانس، وشرط لكميات عالية من العينات البيولوجية من أجل الحصول على محصول جيد من الميتوكوندريا معزولة 7 و 8.
بعد إجراء العزل، ومعدلات التنفس المجمعات الميتوكوندريا I-، ثانيا ورابعا-تعتمد (الدول 2 و 3 و 4) والمحدد باستخدام عالية الدقة قياس التنفس. لالمعقدة يحركها أنا التنفس، الغلوتاماتومالات وأضاف يليه ثنائي فسفات الأدينوزين (ADP). للتنفس معقدة يحركها الثاني، وأضاف تليها السكسينات من ADP. لالمعقدة يحركها الرابع التنفس، أسكوربات وtetramethylphenylendiamine (TMPD) تضاف تليها ADP 9، 10، 11، 12. تشير الدولة 2 إلى استهلاك الأكسجين في وجود ركائز وحدها. تشير الدولة 3 إلى استهلاك الأكسجين في وجود ركائز وشرطة أبوظبي. تشير الدولة 4 إلى استهلاك الأوكسجين بعد نضوب ADP. نسبة سيطرة الجهاز التنفسي (RCR) هو مؤشر اقتران إنتاج ATP استهلاك الأوكسجين ويتم حساب النسبة بين الدولة 3 و 4 الدولة 13 و 15.
باختصار، نحن تصف بروتوكول لعزل الميتوكوندريا العضلات الهيكلية الوظيفية وسليمة عن طريق الطرد المركزي التفاضلي واستخدام هذه mitochon معزولةdria للدراسات الفنية والطاقة البيولوجية مثل عالية الدقة قياس التنفس.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة وصفنا بروتوكول لعزل ذات جودة عالية، سليمة والمقرونة بإحكام الميتوكوندريا العضلات والهيكل العظمي بواسطة الطرد المركزي التفاضلي والتي يمكن استخدامها للدراسات وظيفية مثل عالية الدقة قياس التنفس.
من أجل عزل الميتوك…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).
Materials
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| ATP | Sigma | A 7699 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) | Merck | 1.06129 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Proteinase, bacterial | Sigma | P 8038 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Tissue homogenizer |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
Riferimenti
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).
- Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Vuda, M., et al. Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs. Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).
- Corrêa, T. D., et al. Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis. Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics. 3, (2002).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).
- Graham, J. M. Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).
- Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
- Lombardi, A., et al. Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis. FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).
