בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה
Summary
Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.
Abstract
Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.
Introduction
bioenergetics מיטוכונדריאלי וקיבולות נשימה ניתן ללמוד לא רק בתאי permeabilized או סיבים אלא גם במיטוכונדריה מבודדת. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה שרירי שלד שלם באמצעות צנטריפוגה הפרש למדידות respirometry ברזולוציה גבוהה.
כדי לבודד המיטוכונדריה תילן respirometry, הרקמה הומוגני המיטוכונדריה מבודד על ידי שיטת צנטריפוגה הפרש קונבנציונלית. שיטת צנטריפוגה ההפרש בוסס על centrifugations הרציף (בסדרה של גברת מהירות) של homogenates הרקמות הוצגה לראשונה על ידי Pallade ועמיתים לעבודה כמעט 70 שנים לפני 1. הרקמה טחונה ראשונה באמצעות מספריים הומוגני מכאני בתוך homogenizer זכוכית עם עלי רפוי. לאחר מכן homogenate הוא centrifuged במהירות נמוכה לבין הגלולה וכתוצאה המכילה רקמות רצופות, סלולריתפסולת גרעינים נמחקות. ואז, supernatant היא centrifuged מספר פעמים במהירות גבוהה השבר מועשר המיטוכונדריה נאסף. היתרונות של שיטת צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה הוא כי: i) השיטה היא מהירה המיטוכונדריה יכול להיות מבודדת בתוך 1-1.5 שעות (ניסויי נשימה צריכות להתבצע מהר ככל האפשר); ii) הוא זול; ו- III) הוא יעיל מאוד ואת המיטוכונדריה מתקבלת על ידי צנטריפוגה הפרש טהורה מספיק עבור מבחני respirometry. החסרונות של השיטה צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה הם כי אני) המיטוכונדריה עלול להיגרם מכך נזק ו זוגיים במהלך המגון; ii) את הזיהום של המיטוכונדריה עם מרכיבים תאיים אחרים (יכול להיפתר על ידי שטיפה נוספת גלולת המיטוכונדריה עם צעדים צנטריפוגה נוספים); iii) את האפשרות של בחירה תת-אוכלוסיות המיטוכונדריה שונות, למשל, במהלך שלבי centrifugations ההפרש, mitochondria עם צפופה תחתונה ניתן לשלול 7; ו- IV) בסלולרי המיטוכונדריה שמסביב חסר ורק הנשימה המקסימלי התיאורטית ניתן למדוד. שיטה נוספת לבודד המיטוכונדריה לצורך מבחני respirometry הוא שיפוע צפיפות צנטריפוגה 2. בטכניקה זו, תמצית הרקמות מונחת על פני פתרון של סוכרוז או שיפוע Percoll (עם צפיפות גבוהה יותר בחלק התחתון של צינור צנטריפוגה) ו centrifuged במהירות מסוימת, גרימת המיטוכונדריה כדי להיות מבודדת מרכיבים תאיים אחרים על פי שלהם צפיפויות. שיטה זו משמשת לעתים קרובות לבודד המיטוכונדריה מוח עם זיהום נמוך מאוד מן synaptosomes. עם זאת, המיטוכונדריה הכבד עכברוש המבודד על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות מזוהם מאוד עם אברונים תאיים אחרים 3. אחת המגבלות של שיטה זו היא כי נוכח שיפוע סוכרוז בצינור צנטריפוגה עלול להיקרע כךהמיטוכונדריה לי (הלם אוסמוטי).
בהתאם לסוג של רקמות; ישנם כמה גורמים חשובים שיש להביא בחשבון עבור הבידוד של המיטוכונדריה שלם על ידי צנטריפוגה הפרש. הצורך הראשון הוא homogenize רקמות בצורה עדינה. רקמות רכות כגון כליות, מוח וכבד דורשות כוחות מכאניים עדינים מיושמים במהלך המגון. זאת לעומת רקמות קשות כגון שריר לב ו שלד שדורשים הרבה כוחות מכאניים חזקים. הרקמה הטחונה מטופל בדרך כלל עם proteinase לפני המגון לרכך את הרקמה. כל המאגרים המשמשים במהלך המגון צנטריפוגה צריכים להיות קר כקרח יש pH פיסיולוגי רלוונטי עם כוח יוני האוסמוטי תואם cytosol 4, 5.
אחד היתרונות של לימוד bioenergetics המיטוכונדריה מבודד הוא כי ממברנות פלזמה הסלולר לא צריך להיות permeabilized עם דטרגנטים כגון digitonin או saponin 4, 6, אשר עלול לסכן את שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. יתרון נוסף של המיטוכונדריה המבודד הוא עדר גורמי cytosolic אחרים, אשר עלולים להפריע הניתוח של פונקציות המיטוכונדריה כגון צריכת חמצן. החסרונות של שימוש המיטוכונדריה המבודד הם הבחירה האפשרית של אוכלוסיות המיטוכונדריה מסוימות במהלך שלבי צנטריפוגה, הפגיעה במיטוכונדריה במהלך הומוגניות, ואת דרישת כמויות גבוהות של דגימות ביולוגיות על מנת לקבל תשואה טובה של המיטוכונדריה מבודד 7, 8.
לאחר שהסתיים הליך הבידוד, שיעורי הנשימה של המיטוכונדריה מתחמי אני-, II- ו- IV תלויות (מדינות 2, 3 ו -4) נקבעים באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה. לנשימה מורכבת מונחה לי, גלוטמטו malate מתווספים ואחריו diphosphate אדנוזין (ADP). לנשימה שנייה מונחה מורכבת, succinate מתווסף ואחריו ADP. שכן, נשימת IV מונחה מורכב ascorbate ו tetramethylphenylendiamine (TMPD) מתווסף ואחריו 9 ADP, 10, 11, 12. המדינה 2 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות מצעים לבד. המדינה 3 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות המצעים ADP. המדינה 4 מתייחסת צריכת חמצן לאחר דלדול ADP. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR) הינו מדד של צימוד של ייצור ATP צריכת החמצן, והוא מחושב כיחס בין המדינה 3 ומדינה 4 13, 15.
לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה שרירי שלד פונקציונלי ללא פגע על ידי צנטריפוגה הפרש ולהשתמש mitochon מבודדdria ללימודים פונקציונליים bioenergetic כגון respirometry ברזולוציה גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר הנוכחי אנו מתארים פרוטוקול לבודד באיכות גבוהה, ללא פגם ו המיטוכונדריה שרירי שלד מצמיד בחוזקה על ידי צנטריפוגה הפרש אשר ניתן להשתמש בם עבור מחקרים תפקודיים כגון respirometry ברזולוציה גבוהה.
כדי לבודד המיטוכונדריה שלם מצמידים בח…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).
Materials
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| ATP | Sigma | A 7699 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) | Merck | 1.06129 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Proteinase, bacterial | Sigma | P 8038 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Tissue homogenizer |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
Riferimenti
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).
- Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Vuda, M., et al. Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs. Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).
- Corrêa, T. D., et al. Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis. Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics. 3, (2002).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).
- Graham, J. M. Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).
- Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
- Lombardi, A., et al. Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis. FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).
