고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리
Summary
Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.
Abstract
Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.
Introduction
미토콘드리아 생물 에너지 학 및 호흡기 용량은 투과성이 세포 또는 섬유에서뿐만 아니라 고립 된 미토콘드리아에뿐만 아니라 공부하실 수 있습니다. 본 연구에서는 고해상도 호흡율 측정을위한 차등 원심 분리를 이용하여 그대로 골격근 미토콘드리아를 분리하는 프로토콜을 기술한다.
호흡율 위해 미토콘드리아 손상을 분리하기 위해, 조직을 균일화하고 미토콘드리아는 종래의 차등 원심 분리 방법에 의해 분리된다. 차동 원심 분리 방법은 순차적 회 원심에 처음 Pallade에 의해 도입 된 조직 균질 및 동료 거의 70 년 전 1의 (증가 속도의 직렬)을 기반으로합니다. 조직은 처음 가위를 사용하여 다진과 헐렁한 유봉과 유리 균질에서 기계적으로 균질화한다. 그 후 균질 저속 깨지지 조직을 포함하는 생성 된 펠릿 세포 원심 분리파편과 핵은 폐기된다. 그 후, 상등액을 고속으로 여러 번 원심 분리하여 농축 된 미토콘드리아 분획을 수집한다. 차등 원심 분리 방법의 장점은 미토콘드리아가있는 분리하기 : ⅰ) 상기 방법은 빠르며 미토콘드리아 (호흡 실험 최대한 빠른 같이 수행되어야한다) 1-1.5 시간 내에 분리 할 수있다; ⅱ)이 저렴하다; 및 ⅲ) 그것은 매우 효율적입니다 및 차등 원심 분리하여 얻은 미토콘드리아는 호흡율 분석을위한 충분한 순수하다. 차동 원심 분리 방법의 단점은 미토콘드리아는 분리하기가 ⅰ) 미토콘드리아가 손상 및 균질화 동안 비 결합 얻을 수 있습니다; ⅱ) 다른 세포 구성 요소와 미토콘드리아 (의 오염은 더 세정 추가 원심 분리 단계와 미토콘드리아 펠렛)에 의해 해결 될 수있다; ⅲ) 차동 회 원심 단계 동안 예를 들어, 다른 개체군 미토콘드리아를, 선택의 가능성, MIT낮은 밀도와 ochondria 7을 제외 할 수 있습니다; 및 ⅳ) 미토콘드리아 세포 주변 누락 단지 이론적 최대 호흡을 측정 할 수있다. 호흡율 분석법 미토콘드리아를 분리하는 또 다른 방법은 밀도 구배 원심이있다. 에 따라 다른 세포 성분으로부터 분리 될 미토콘드리아 원인이 기술에서, 조직 추출물 자당 또는 (원심 분리 튜브의 하단보다 높은 밀도)를 퍼콜 구배 용액 위에 적층되고, 소정의 속도로 원심 분리하여 그 밀도. 이 방법은 종종 시냅 토좀 (synaptosome)에서 매우 낮은 오염 미토콘드리아 뇌를 분리하기 위해 사용된다. 그러나, 밀도 구배 원심 분리에 의해 단리 래트의 간 미토콘드리아는 매우 다른 세포 소기관 (3)로 오염된다. 이러한 방법의 한계 중 하나는 원심 분리 튜브 내의 수크로오스 구배 본 너무 파열 수도 있다는나 미토콘드리아 (삼투압 충격).
조직의 유형에 따라, 차동 원심 분리하여 손상 미토콘드리아의 분리를 위해 고려해야 할 몇 가지 중요한 요소가있다. 첫 번째 필요성은 부드러운 방식으로 조직을 균질화하는 것입니다. 이러한 신장, 뇌, 간 등의 부드러운 조직을 균질화 동안 적용 부드러운 기계적 힘을 필요로한다. 이것은 훨씬 더 강한 기계적인 힘을 필요로 심장과 골격 근육 열심히 조직과 대조. 다진 조직은 일반적으로 이전에 조직을 부드럽게 균질화에 단백질 분해 효소로 처리됩니다. 균질화 및 원심 분리 동안 사용 된 모든 버퍼는 차가운 얼음하고 세포질 4, 5와 호환 이온과 삼투 강도 생리 관련 pH가 있어야합니다.
절연 미토콘드리아 생체 에너지 연구의 장점 중 하나는 세포 원형질막 permeabi가있을 필요가 없다는 것이다미토콘드리아 외막 무결성을 손상 수있는 등 디기 토닌 또는 사포닌 4, 6 등의 세제와 함께하게 안정적. 단리 된 미토콘드리아의 또 다른 장점은 산소 소비 미토콘드리아 기능의 분석을 방해 할 수있는 다른 세포 내 인자의 부재이다. 단리 된 미토콘드리아를 사용하는 단점은 원심 분리 단계 동안 특정 미토콘드리아 인구의 가능한 선택 균질화시 미토콘드리아 손상 고립 미토콘드리아 7, 8의 양호한 수율을 얻기 위해서 생물학적 시료의 높은 양에 대한 요구이다.
분리 과정을 거친 후, 미토콘드리아 복합체의 호흡 속도 I-, 및 IV II- 의존성 (주 2, 3, 4)는 고해상도 호흡율을 사용하여 결정된다. 복잡한 I-구동 호흡, 글루타메이트에 대한및 말산은 아데노신이 인산염 (ADP) 다음에 추가됩니다. 복잡한 II 중심의 호흡을 위해, 숙시 네이트는 ADP 다음에 추가됩니다. 복잡한 IV 구동 호흡, 아스 코르 베이트 및 tetramethylphenylendiamine (TMPD) 미국 ADP 9, 10, 11, 12을 첨가한다. 상태 2 형 기질의 존재 하에서 산소 소비를 지칭한다. 상태 3은 기판 및 ADP의 존재하에 산소 소비를 지칭한다. 주 4 ADP 고갈 후 산소 소비를 의미한다. 호흡 조절 비율 (RCR)은 산소 소모 ATP 생산의 결합의 지표이고, 상태 3, 상태 4 (13), (15) 사이의 비율로서 계산된다.
요약하면, 우리는 차동 원심 분리에 의해 기능적 손상 골격근 미토콘드리아를 분리하고 이러한 고립 mitochon를 사용하는 프로토콜을 기술높은 해상도 호흡율과 같은 기능과 생체 에너지 연구 dria.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서 우리는 고품질의 손상 및 고해상도 호흡율 기능성 연구에 사용할 수있는 차등 원심 분리에 의해 단단히 결합 골격근 미토콘드리아를 분리하는 프로토콜을 기술한다.
손상과 밀접하게 결합 미토콘드리아를 분리하기 위해, 본 프로토콜 내에서 고려되어야 할 몇 가지 한계점이있다. 골격 조직을 채취 후, 즉시 빙냉 미토콘드리아 차단 완충액에 침지한다. 모든 원?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).
Materials
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| ATP | Sigma | A 7699 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) | Merck | 1.06129 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Proteinase, bacterial | Sigma | P 8038 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Tissue homogenizer |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
Riferimenti
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