De<em> Ex Vivo</em> Colon Organ Kultur og dets bruk i Antimicrobial Host forsvarsstudier
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
Tarmen viser en arkitektur av repetitive krypten strukturer bestående av forskjellige typer epitelceller, lamina propria inneholder immunceller og stroma. Alle disse heterogene celler som bidrar til intestinal homeostase og delta i antimikrobiell vertens forsvar. Derfor, identifisere en surrogatmodell for å studere immunrespons og antimikrobiell aktivitet i tarmen i en in vitro-innstillingen er ekstremt krevende. In vitro studier ved bruk av udødeliggjorte intestinale epitel-cellelinjer eller til og med primær krypt organoid kulturen ikke representerer den nøyaktige fysiologi normal tarmen og dens mikromiljøet. Her har vi diskuterer en fremgangsmåte for dyrkning mus colon vev i en dyrkningsskål og hvordan denne ex vivo organ kultursystem kan gjennomføres i studier relatert til antimikrobielle vertsforsvarsresponser. I representative eksperimenter viste vi at kolon i organkultur uttrykke antimikrobielle peptider i hhvonse til eksogent IL-1β og IL-18. Videre kan de antimikrobielle effektor molekyler produsert av kolon vev i organkultur effektivt drepe Escherichia coli in vitro. Denne tilnærmingen kan derfor benyttes til å dissekere rolle pathogen- og fare-assosierte molekylære mønstre og deres cellulære reseptorer i regulering av tarm medfødte immunresponser og antimikrobielle vertsforsvarsresponser.
Introduction
Tarmen representerer et dynamisk system som fungerer som en barriere for kommensale mikroorganismer, kjemper mot invaderende patogener, og regulerer den mikrobielle sammensetningen 1. Intestinal epitelceller, som består av enterocytes, slimceller, Paneth celler og enteroendocrine celler, er de store cellepopulasjoner som gir vertsforsvarsresponser mot tarmfloraen. Slimcellene produserer slimstoffer som skaper en demineralisert sone på toppen av epitellaget 2. De Paneth celler og enterocytes produsere antimikrobielle peptider, cytokiner, og reaktive oksygen- og nitrogenforbindelser som utgjør antimikrobielle vert forsvar svar og bidrar til å forme tarm mikrobiell sammensetning 3, 4. I tillegg til epitelceller, immunceller, inkludert makrofager, dendrittiske celler, neutrofiler og naturlige drepeceller, lymfocytter, og inna te lymfoide celler i lamina propria og submucosa spille en avgjørende rolle i tarm antimikrobielle vert forsvar svar ved å produsere cytokiner, kjemokiner og andre meklere 5 – 7. For å forstå hvordan det mukosale immunsystemet regulerer bakterieflora og gir beskyttelse mot mikrobiell infeksjon, er det viktig å vurdere et komplekst samspill mellom de heterogene cellepopulasjoner i tarmen. Men en in vitro modell som omfatter alle funksjonene i tarmen er ikke tilgjengelig. Derfor molekylære studier på host-patogen interaksjoner i tarmen er svært utfordrende.
I løpet av de siste årene har flere modellsystemer som etterligner deler av tarmslimhinnen blitt utviklet for å undersøke de patofysiologiske prosessene som er involvert i inflammatoriske tarmsykdommer (IBD) og andre gastrointestinale forstyrrelser 8 –= "xref"> 14. Udødeliggjorte intestinale epitel-cellelinjer blir ofte brukt til å studere epiteliale celle spesifikke responser. Men på grunn av differensial genekspresjon og funksjon i udødeliggjorte celler blir data oppnådd fra ved hjelp av disse cellene ofte ikke samsvarer med de som ble observert i in vivo studier. Intestinal krypten organoid kultur nylig har dukket opp som et potensielt verktøy for å vurdere responsen tarmepitelet til ulike stimuli 13. I dette systemet, er krypten stamceller lov til å vokse og utvikle en 3D organoid struktur. Mens organoid kultursystem er meget nyttig for å studere mange aspekter av tarmepitelet, den ikke etterligne et komplekst samspill av immunceller, epitelceller og mikrobielle produkter. Den ex vivo kultur av tarmvevet har en bedre representasjon av in vivo-vertsforsvarsresponser. I denne fremgangsmåten blir en del av tarmen er dyrket i et cellekulturplate vetth egnede media slik at de forskjellige typer av celle populasjoner i tarmen for å være metabolsk aktive i minst 48 timer. Således kan en ex vivo kultur av organet benyttes for å måle ekspresjonen av antimikrobielle gener og vertsforsvarsresponser i tarmen til et bestemt stimulus.
Etterforskerne har brukt ex vivo orgel kultur system for å studere vertsforsvarsresponser mot mikrobiell infeksjon i tarmen 15-21. Vi har nylig vedtatt orgelet kultur system for å studere rollen til inflammasome i antimikrobielle vert forsvar svar i mus kolon 22. Den inflammasome er en molekylær plattform for aktivering av kaspase-1, som er nødvendig for fremstillingen av modne IL-1β og IL-18. Vi viste at IL-1β og IL-18 induserer antimikrobielle peptider som effektivt dreper commensal pathobionts som E. coli </em>. Denne observasjonen var i samsvar med økt E. coli byrde i inflammasome-defekte mus kolon 22. Dette systemet kan derfor brukes til å studere rollen til mønstergjenkjennings reseptorer (PRRS) og andre medfødte immunmolekyler i tarm antimikrobielle vertsforsvarsresponser, samt patogenesen av tarmsykdommer som for eksempel inflammatorisk tarmsykdom (IBD) og tykktarmskreft (CRC). Det er mer enn 200 IBD resistensgener, og mutasjoner i mange av disse genene er assosiert med endret mikrobiell sammensetning i tarmen. Det er av stor klinisk betydning for å fastslå den nøyaktige mekanisme som de IBD-mottakelighet gener regulerer tarmfloraen. Det overordnede målet med denne metoden er å innføre en grunnleggende protokollen av ex vivo tykktarm orgel kultur og vise hvordan denne kulturen metoden kan brukes til å studere antimikrobielle vert forsvar svar av tarmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den intestinale epitelceller er meget følsomme med hensyn til deres vekst krav, og derfor vanskelige å dyrke. Epitelcellene isolert ved EDTA behandling ikke overlever i konvensjonelle cellekulturmedier slik som DMEM 8. Derfor vert-patogen interaksjonsstudier med isolert krypten eller primære epitelceller er svært utfordrende. Nylig, Sato et al. beskrev en krypt organoid kultur system som er svært lovende og nyttig for studier knyttet til intestinal patofysiologi 13. M…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av midler fra Crohns og Foundation of America kolitt, (CCFA; 3711) Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT; RP160169), og UT Southwestern Medical Center gitt til MHZ
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
Riferimenti
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).
- Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota. Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).
- Wu, H. J., Wu, E. The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity. Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).
- Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).
- Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. Innate immunity in disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).
- Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. Intestinal epithelial cells in vitro. Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).
- Autrup, H. Explant culture of human colon. Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).
- Qin, J., et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature. 464, 59-65 (2010).
- Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. A major advance in ex vivo intestinal organ culture. Gut. 61, 961-962 (2012).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. 63, 1345-1354 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61, 1007-1015 (2012).
- Haque, A., et al. Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants. Gut. 53, 1424-1430 (2004).
- Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro. Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).
- Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies. Infect Immun. 44, 514-518 (1984).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J Anat. 134, 459-469 (1982).
- Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli. Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).
- Bareiss, P. M., et al. Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa. Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).
- Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants. J Vis Exp. , e4368 (2013).
- Hu, S., et al. The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense. Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).
- Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium. J Pathol. 180, 102-105 (1996).
- Dame, M. K., et al. Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).
- Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni. FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).
